细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

目的 研究细菌脂多糖(LPS)对培养的大鼠星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)表达的影响.方法 培养的星形胶质细胞随机分为空白对照组、LPS单一刺激组、LPS联合PKC抑制剂(RO-31-8220)刺激组.运用荧光定量PCR(Real time RT-PCR)、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位.结果 Real time RT-PCR显示,LPS可以上调SSeCKS mRNA水平,在作用浓度为100 μg/L和1 mg/L时与对照组有显著差异(P＜0.01).Western blotting表明,当LPS作用浓度为100 μg/L时,SSeCKS蛋白表达量明显上调;在此浓度作用下,SSeCKS表达于6 h达高峰并广泛磷酸化,至24 h其蛋白表达仍维持于较高水平.免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于胞质,于胞膜略有浓集.在LPS单一刺激组,SSeCKS富集于核周;当LPS联合RO-31-8220共同作用时,SSeCKS的亚细胞定位与正常组无明显差异.结论 在体外培养的星形胶质细胞中,LPS可诱导SSeCKS表达,上调其磷酸化水平,影响其细胞内定位.这些改变与PKC的功能相关.提示SSeCKS可能参与星形胶质细胞中炎症信号的转导.     

大鼠脑损伤后SSeCKS的表达变化

目的:探讨大鼠脑损伤后,SSeCKS(Src抑制的蛋白激酶C的底物)在脑组织中的表达变化及其意义。方法:制备成年SD(Sprague-Dawley)大鼠脑损伤模型。通过Western blot和RT-PCR方法检测脑损伤后SSeCKS表达的时相变化,免疫组织化学方法检测SSeCKS在脑组织中的细胞定位。结果:Western blot显示,大鼠脑损伤后,SSeCKS的表达逐步降低,伤后3d降至最低点,之后逐渐上升,7d达到高峰,14d后趋于平稳;RT-PCR的结果与Western blot一致。免疫荧光双标记结果显示SSeCKS与星形胶质细胞的标记物GFAP、神经元的标记物NeuN共定位。结论:大鼠脑损伤可以改变SSeCKS的表达,这种改变可能参与脑损伤后星型胶质细胞的活化和增殖过程,并与神经元的凋亡、轴突再生有关。     

炎性因子IL-1β对星形胶质细胞抗氧化应激能力的影响

目的:本研究应用原代培养星形胶质细胞,探讨炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)对星形胶质细胞抗氧化应激能力的影响。方法:在原代星形胶质细胞培养中分别加入1 ng/ml IL-1β,流式细胞仪检测不同作用时间(0、24、48、72 h)细胞线粒体膜电位改变,激光共聚焦显微镜观察活性氧(ROS)生成,分光光度法检测细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,RT-PCR、Western Blot检测星形胶质细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达变化。结果:1 ng/ml IL-1β处理原代培养星形胶质细胞24~72 h,细胞线粒体膜电位无明显改变,细胞未出现明显损伤。IL-1β孵育24 h,细胞内ROS生成减少,GSH生成增加;48 h细胞内ROS生成增加,GSH较24 h组减低(P0.05);72 h,原代培养星形胶质细胞内ROS生成明显增加,GSH较0 h组降低(P0.05)。1 ng/ml IL-1β处理原代培养星形胶质细胞24 h,细胞内GSH-Px mRNA及蛋白水平较0 h组升高(P0.05);但仅是一过性反应,IL-1β孵育72 h后,原代培养星形胶质细胞内GSH-Px mRNA及蛋白水平均较0 h组降低(P0.05)。结论:持续炎性因子刺激下,星形胶质细胞抗氧化应激能力呈现动态改变,并且细胞内抗氧化物参与此变化过程。     

LPS对大鼠肺微血管内皮细胞SSeCKS的表达影响

目的研究细菌脂多糖（LPS）对大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cell，RPMVEC）Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）表达和细胞内定位的影响，探讨SSeCKS参与细胞骨架结构改变的可能机制。方法用植块培养法体外培养大鼠肺微血管内皮细胞，用抗大鼠CD31抗体进行细胞鉴定。LPS刺激体外培养的RPMVEC，用定量PCR、免疫印迹方法检测LPS刺激RPMVEC不同时间SSeCKS mRNA和蛋白的表达情况；用0．05μmol／L蛋白激酶C（PKC）抑制剂（Calphostin C）预处理RPMVEC30min后再用LPS刺激6h，免疫荧光细胞化学法观察Calphostin C对LPS诱导SSeCKS与纤维状肌动蛋白（filamentous—actin，F-actin）细胞内定位和结构改变的影响。结果定量PCR结果显示LPS刺激RPMVEC1h后SSeCKS表达水平达到最高，Westernblot结果与定量PCR结果相一致，同时，LPS以时间依赖的方式诱导SSeCKS磷酸水平增加。免疫荧光结果显示LPS刺激后，F-actin发生重构，细胞内形成应力纤维，SSeCKS向核周、细胞膜纤维、板状伪足末端聚集；Calphostin C部分抑制LPS对内皮细胞F-actin和SSeCKS细胞内定位改变的影响。结论LPS能够诱导内皮细胞SSeCKS表达增加和细胞内定位改变，PKC参与I娲诱导内皮细胞F-ac，6n的重构和SSeCKS重新分布；提示SSeCKS可能与LPS诱导内皮细胞F-actin的重构有关。     

硫辛酸抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞细胞因子及趋化因子的表达

目的探讨硫辛酸(LA)对脂多糖(LPS)激活的星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10及相关趋化因子的影响。方法分离并鉴定新生C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞,1μg/mL LPS刺激第2代星形胶质细胞,100μg/mL LA进行干预,Griess法检测NO的分泌,ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10炎性因子的含量,反转录PCR检测炎症趋化因子CC亚族趋化因子配体20(CCL20),单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)mRNA的表达。结果与正常组比较,LPS刺激星形胶质细胞后,NO、TNF-α、IL-1β、IL-6分泌显著升高,IL-10分泌下调(P0.05);LA能抑制LPS诱导的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,增加IL-10的分泌,与LPS组相比差异有统计学意义(P0.05)。LA能显著下调LPS所致的CCL20、MIP-1α、MCP-1 mRNA的分泌。结论 LA能抑制LPS激活星形胶质细胞所致的炎性反应,其作用与抑制炎性因子及趋化因子的分泌有关。     

创伤性脑损伤后白细胞介素1β在星形胶质细胞中的表达

目的:探究创伤性脑损伤后白细胞介素1β(IL-1β)在星形胶质细胞中的表达。方法:采用免疫印迹半定量检测创伤性脑损伤后IL-1β、星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,免疫荧光双重染色检测IL-1β在星形胶质细胞中的定位表达。结果:IL-1β表达在损伤后8 h就有增高,1 d时最高,4 d时有所降低,且1 d和4 d时可定位表达在星形胶质细胞中。结论:损伤后增高的IL-1β表达可能对促进星形胶质细胞的活化具有重要的调节作用。     

Fasudil对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的作用

目的:确认法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果,观察法舒地尔对小胶质细胞和星形胶质细胞的作用.方法:成年雌性C57BL/6小鼠用MOG35-55肽免疫制作慢性EAE模型,分别随机在免疫后第3天(Fasudil早期治疗组)和发病时给予Fasudil(Fasudil晚期治疗组),以同样方式给予生理盐水作为对照.观察临床症状和体质量变化;采用免疫荧光组织化学染色、Western blot 法检测脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞iNOS和p-NF-κB/p65的表达,ELISA测定脊髓匀浆中IL-1β和TNF-α水平.结果:Fasudil推迟EAE起病,减轻EAE症状,抑制脊髓中小胶质细胞iNOS以及星形胶质细胞p-NF-κB/p65表达,并伴随炎性因子IL-1β和TNF-α释放降低.结论:Fasudil可抑制EAE小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞炎性分子的释放.     

C1型尼曼-匹克症小鼠脊髓胶质细胞的活性变化

目的通过观察C1型尼曼-匹克症小鼠不同脊髓节段星形胶质细胞和小胶质细胞的活性变化,探讨Npc1基因突变对脊髓发育的影响。方法 Npc1~(+/-)小鼠交配繁殖产生Npc~(1-/-)(n=3)和Npc1~(+/+)小鼠(n=3),PCR检测新生小鼠的基因型;选取35日龄的Npc1~(-/-)和Npc1~(+/+)小鼠,采用免疫荧光方法观察对比脊髓不同节段(颈、胸、腰、骶)星形胶质细胞和小胶质细胞的活性变化。采用免疫双染色检测胶质细胞中炎性因子的表达情况,采用免疫印迹方法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、SMI31和磷酸化的tau蛋白表达情况。结果在35日龄Npc1~(-/-)小鼠脊髓的各个节段,其背角和腹角的星形胶质细胞和小胶质细胞的活性均明显增强(P0.05),并伴随细胞炎性因子IL-1β表达量的显著增加;同时,脊髓神经丝蛋白和骨架蛋白tau蛋白发生超磷酸化。结论 Npc1基因突变引起脊髓神经胶质细胞发生病理性变化,可能是脊髓神经元病理性损伤的重要原因。     

IL-1β和NF-κB在慢性内侧颞叶癫痫模型中的相互作用

目的:观察白介素1β(IL-1β)与核因子-κB(NF-κB)在大鼠内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)模型中的表达变化;体外培养的星形胶质细胞经IL-1β和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理后,观察其增殖和NF-κB表达变化。方法:利用匹罗卡品诱导SD大鼠发作癫痫制成MTLE模型,根据自发发作出现和稳定时间分为急性期对照组(AC,制模后2 h)、急性期癫痫组(AS)、潜伏期对照组(LC,制模后3周)、潜伏期癫痫组(LS)、慢性期对照组(CC,制模后8周)和慢性期癫痫组(CS)。体外培养的星形胶质细胞分为对照组、IL组和PDTC+IL组,利用凝胶迁移电泳(EMSA)、免疫印迹(WB)、酶联免疫吸附(ELISA)和免疫组织化学(IHC)的方法观察IL-1β和NF-κB的表达变化;MTT检测星形胶质细胞的增殖活化程度。结果:匹罗卡品诱导的MTLE模型大鼠海马内IL-1β和NF-κB在急性期、潜伏期和慢性期表达均增加,但以急性期和慢性期明显;IL-1β可以促进体外培养的星形胶质细胞增殖、上调星形胶质细胞内NF-κB的表达,而PDTC可以明显抑制IL-1β的上述作用。结论:IL-1β通过NF-κB促进大鼠星形胶质细胞的活化增殖,这一改变可能与MTLE发病密切相关,探讨其机制可能为MTLE的治疗提供新的靶点。     

蛋白激酶B受体在大鼠脑星形胶质细胞的表达及其磷酸化

目的:研究大鼠脑星形胶质细胞蛋白激酶B受体(TrkB)的表达及其信号转导通路。方法:用生后2~3dSD大鼠,在无菌条件下取脑,制备细胞悬液,以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞;以RT-PCR法研究星形胶质细胞TrkB、ERK1、ERK2 mRNA表达,用蛋白印迹和免疫细胞化学法研究星形胶质细胞TrkB、ERK1、ERK2蛋白表达。用蛋白印迹法检测脑源性神经营养因子(BDNF)作用后的星形胶质细胞p-TrkB。结果:星形胶质细胞的纯度达95%以上,RT-PCR结果显示星形胶质细胞表达TrkB、ERK1、ERK2 mRNA,蛋白印迹及免疫细胞化学法显示星形胶质细胞表达TrkB、ERK1、ERK2蛋白。BDNF作用1h后TrkB磷酸化,K252a可阻止TrkB磷酸化。结论:培养的大鼠星形胶质细胞表达TrkB、ERK1、ERK2;BDNF可使TrkB磷酸化,TrkB与星形胶质细胞信号转导有关。     

雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓内胶质细胞的激活改善大鼠CFA诱导的炎性痛的机制研究

目的:观察腹腔注射雷公藤内酯醇(Triptolide,T10)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的大鼠慢性炎性痛行为的改善作用并探讨其机制。方法:SD大鼠随机分为四组,即Saline+Veh组、Saline+T10组、CFA+Veh组和CFA+T10组。后两组大鼠于右侧足底注射CFA制备大鼠慢性炎性痛模型,前两组则在相同部位注射生理盐水。第二组和第四组大鼠分别于造模前1 h给予T10腹腔注射,随后每12 h给予腹腔注射药物1次,持续用药7 d;第一组和第三组则以相同方式给予100 ml/kg的生理盐水作为对照。采用辐射热法和机械刺激法连续观察给药后大鼠的痛行为;应用免疫组织化学染色和Western Blot方法观察连续给予T10 3d和7 d后大鼠腰膨大平面脊髓背角内小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度;应用实时定量PCR(RT-PCR)方法观察连续给药7 d后大鼠腰5背根神经节内炎性因子,如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)的表达变化。结果:(1)与CFA+Veh组相比,CFA+T10组大鼠机械缩足阈值及辐射热痛潜伏期显著下降(P0.05),并持续到造模成功后7 d,表明腹腔注射T10可以明显改善CFA诱导的大鼠机械痛敏和辐射热痛敏。(2)免疫组织化学染色和Western Blot结果显示:造模后3 d和7 d后CFA+Veh组大鼠脊髓背角出现大量CFA诱导活化的小胶质细胞和星形胶质细胞;小胶质细胞标记物IBa-1和星形胶质细胞标记物GFAP的表达量分别在CFA造模后3 d和7 d显著增高(P0.05),而给予T10 3 d和7 d后炎性痛大鼠腰膨大平面IBa-1和GFAP的活化程度均显著减轻(P0.05)。(3)RT-PCR结果显示:与Saline+Veh组相比,CFA造模7 d后腰5背根神经节内炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA的表达显著增高(P0.05),腹腔注射T10 7 d后上述炎性因子的表达则显著降低(P0.05)。结论:腹腔注射T10可以显著改善CFA诱导的大鼠慢性炎性痛,其机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成有关。     

犀角地黄汤合银翘散通过PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α诱导的肺微血管内皮细胞通透性增加

目的:观察犀角地黄汤合银翘散(XDY)对TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性的影响及其与PKC-SSeCKS信号通路的关系,以探究该方治疗病毒性肺炎的作用环节和分子机制。方法:原代培养大鼠PMVEC,在Transwell小室上用电导法于不同时点监测TNF-α诱导的PMVEC跨内皮细胞单层电阻(TER)测定其通透性。不同的干预因素作用24 h后,检测PMVEC的TER、PKC活性、SSeCKS mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平,激光共聚焦显微镜观察PMVEC中SSeCKS的定位和F-actin的结构变化。结果:TNF-α作用24 h后PMVEC通透性达高峰;与对照组比较,TNF-α组TER降低,PKC活性增强;与TNF-α组比较,TNF-α加PKC抑制剂组和TNF-α加XDY含药血清组PKC活性降低,而TER升高且与对照组无差别。与对照组比较,TNF-α组SSeCKS的mRNA和蛋白表达升高;与TNF-α组比较,TNF-α加XDY含药血清组SSeCKS的mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平降低。对照组PMVEC中F-actin主要分布在细胞周边和核周,形成致密周围束,SSeCKS均匀散在分布于细胞中;TNF-α组细胞周边的F-actin致密束基本消失,SSeCKS集中分布于核周;TNF-α加含XDY含药血清组F-actin结构及SSeCKS的分布趋于正常。结论:犀角地黄汤合银翘散可以抑制TNF-α诱导的PMVEC PKC信号通路的激活,降低PKC结合底物SSeCKS的表达,最终影响肌动蛋白的变构、阻止内皮细胞变形而降低PMVEC的通透性。     

脂多糖活化星形胶质细胞并下调其内向整流性钾离子通道(Kir4.1)的表达

目的探讨脂多糖(LPS)对星形胶质细胞的活化作用及内向整流性钾离子通道4.1(Kir4.1)表达的影响。方法分离培养新生SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞;LPS处理或者和白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)处理培养的细胞,MTT法检测细胞活力,免疫细胞化学技术检测星形细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,ELISA检测细胞培养上清中的IL-1β的水平,实时定量PCR法检测星形胶质细胞IL-1β和Kir4.1 mRNA的表达情况。结果 LPS促进星形胶质细胞的活化具有浓度和时间依赖性。LPS可促进星形胶质细胞IL-1β的分泌和IL-1βmRNA的表达,下调Kir4.1 mRNA的表达;与LPS组相比较,IL-1ra可以有效对抗上述两结果。结论 LPS可诱导培养的星形胶质细胞活化;LPS下调星形胶质细胞Kir4.1 mRNA表达可能与IL-1β有关。     

细胞外调节蛋白激酶在体外培养下大鼠大脑皮质星形胶质细胞的表达

目的:研究大鼠大脑皮质星形胶质细胞细胞外调节蛋白激酶(ERK)表达.方法:用生后2～3d SD大鼠,在无菌条件下取大脑皮质,制备细胞悬液,以GFAP鉴定星形胶质细胞;用免疫细胞化学方法研究星形胶质细胞ERK1表达.结果:星形胶质细胞的纯度达95%以上,ERK1免疫阳性物质呈棕黄色,分布于星形胶质细胞胞体与突起中.结论:培养的大鼠星形胶质细胞表达ERK1,其可能与星形胶质细胞信号转导有关.     

C3H1型锌指结合蛋白36介导的星形胶质细胞活化在肌萎缩侧索硬化症运动神经元退变中的作用

目的 探讨C3H1型锌指结合蛋白36（ZFP36L1）介导的星形胶质细胞活化在肌萎缩侧索硬化症（ALS）运动神经元退变中的作用。 方法 以铜锌超氧化物歧化酶1（SOD1)-G93A转基因小鼠作为动物模型,同窝野生型小鼠作为对照（突变型及野生型小鼠各时间点分别取13只小鼠）;Real-time PCR、Western blotting检测小鼠发病早期、中期及晚期脊髓内ZFP36L1 mRNA及蛋白变化,免疫荧光染色检测ZFP36L1在脊髓内的表达及分布;出生后 1～2 d新生小鼠15只,建立SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞模型,Real-time PCR、Western blotting检测星形胶质细胞内ZFP36L1 mRNA及蛋白水平的变化,si-ZFP36L1转染SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞,Western blotting检测转染效率,Western blotting及ELISA检测转染后星形胶质细胞分泌炎性因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素18（IL-18）变化;沉默SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞内ZFP36L1后,与SOD1-G93A突变型NSC34细胞共培养,通过5’-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）实验和观察增殖细胞核抗原（PCNA）的水平明确ZFP36L1对NSC34细胞增殖的影响,通过TUNEL实验及观察剪切Caspase-3（cleaved-Caspase-3）的水平明确ZFP36L1对NSC34细胞凋亡的影响,以转染空白小干扰RNA（siRNA）作为对照组。 结果 与野生型小鼠相比,ZFP36L1在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓组织内mRNA及蛋白水平均下调,在野生型小鼠脊髓组织内,ZFP36L1主要与β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）阳性的神经元共表达,而SOD1-G93A突变型小鼠的脊髓组织内,ZFP36L1在神经元内表达减弱,与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标记的星形胶质细胞共表达明显增加;SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞内ZFP36L1表达增加,si-ZFP36L1能明显降低SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞内ZFP36L1水平;沉默ZFP36L1后星形胶质细胞分泌炎性因子 TNF-α、 IL-18明显降低。此外,沉默ZFP36L1后,SOD1-G93A突变型原代星形胶质细胞能显著增强NSC34细胞增殖活性,抑制NSC34细胞凋亡。 结论 在ALS发病过程中,星形胶质细胞被激活,ZFP36L1通过星形胶质细胞分泌的炎性因子促进了ALS运动神经元的退变。     

ROCK1及其相关信号分子参与张应变调控的血管平滑肌细胞增殖

目的探讨Rho相关卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)及其相关信号分子在感受张应变机械刺激、调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖功能中的作用。方法应用张应变加载系统对体外培养VSMCs施加牵张幅度10%、频率1.25 Hz生理性周向张应变;Brdu检测VSMCs增殖水平;Western blotting检测力学加载后VSMCs的ROCK1表达水平以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)α/βII、蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)、胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化水平;采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)检测ROCK1对VSMC增殖和PKCα/βII、PKD、ERK磷酸化的调控作用。结果 10%生理性张应变加载12、24 h显著抑制VSMCs的ROCK1表达,并显著抑制PKD和ERK的磷酸化;10%生理性张应变加载12 h显著抑制PKCα/βⅡ的磷酸化,但加载24 h PKCα/βⅡ的磷酸化与静止对照组相比无显著差异。RNAi抑制VSMCs的ROCK1表达后,VSMCs增殖水平显著降低,同时PKCα/βⅡ和PKD磷酸化水平显著降低,但ERK磷酸化无明显变化。结论 10%生理性张应变可能通过抑制ROCK1表达调控PKCα/βⅡ和PKD的磷酸化水平,从而影响VSMCs增殖,维持血管稳定性。探讨张应变力学刺激调控血管细胞功能的细胞内信号转导网络,对心血管生理和疾病病理机制研究具有一定意义。     

8-O-乙酰山栀子苷甲酸通过抑制脊髓背角JNK的磷酸化水平改善大鼠炎性痛的研究

目的:探究8-O-乙酰山栀子苷甲酸(8-O-acetyl-SM,8-Oa S)对于慢性炎性痛模型大鼠痛行为及脊髓背角星形胶质细胞内c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平的影响。方法:运用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)的方法建立慢性炎性痛模型;通过腹膜腔注射8-Oa S进行干预;采用von Frey丝测定大鼠足底50%机械性缩足反射阈值;应用免疫荧光组织化学染色法观察大鼠腰膨大节段脊髓背角胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及磷酸化的JNK(phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase,p JNK)表达;应用Western Blot方法对大鼠脊髓背角内GFAP、JNK以及p-JNK的表达水平进行定量分析。结果:(1)行为学结果显示:与对照组相比,CFA模型大鼠机械性痛阈明显降低(P0.01),腹膜腔注射8-Oa S可有效提高CFA诱导的机械性痛阈值(P0.05);(2)免疫荧光染色结果显示:CFA模型脊髓背角内GFAP的表达量明显高于正常组,且p JNK基本表达于星形胶质细胞内;(3)Western Blot结果显示:与对照组相比,CFA造模后7 d脊髓背角内GFAP和p JNK表达明显上调,腹膜腔给予8-Oa S可以显著下调CFA诱导的脊髓背角内GFAP和p JNK的水平(P0.01)。结论:腹膜腔内给予8-Oa S可有效提高炎性痛大鼠的机械性痛阈,其机制是通过下调脊髓背角星形胶质细胞内JNK信号通路的磷酸化水平进而抑制星形胶质细胞的激活。     

TFPI-2对缺氧大鼠星形胶质细胞生物学特性及机制的研究

目的:研究组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)对缺氧大鼠星形胶质细胞生物学特性的影响,探讨其对大鼠星形胶质细胞缺氧保护的机制。方法:从大鼠脑组织中分离培养星形胶质细胞,将细胞作缺氧处理,分别采用qRT-PCR和Western blot法检测星形胶质细胞中TFPI-2表达水平。在星形胶质细胞中转染TFPI-2 siRNA后,采用qRT-PCR和Western blot法检测TFPI-2基因沉默效果,MTT检测星形胶质细胞增殖,流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡情况,qRT-PCR检测星形胶质细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)mRNA表达水平。结果:Hypoxia组星形胶质细胞中TFPI-2 mRNA水平和蛋白水平明显高于Control组星形胶质细胞,转染TFPI-2 siRNA后,si-TFPI-2组星形胶质细胞中TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平明显低于si-control组细胞,差异有统计学意义(P0. 05)。缺氧星形胶质细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高,与正常培养的星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。对缺氧星形胶质细胞敲减TFPI-2后,细胞存活率升高,细胞凋亡率和细胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,与缺氧星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。结论:下调TFPI-2可以促进缺氧星形胶质细胞增殖,抑制细胞凋亡,其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

白藜芦醇通过调节miR-223-3p/NLRP3通路发挥对幼年大鼠脑膜炎模型皮质神经元的保护作用

目的:探究白藜芦醇在大鼠细菌性脑膜炎(BM)模型中对皮质神经元的保护作用及机制。方法:通过小脑延髓池注射B族溶血性链球菌制作BM模型,经鼻滴注白藜芦醇,并经侧脑室注射微小RNA-223-3p(miR-223-3p)antagomir。HE染色观察脑膜炎组织病理结构的改变;Loeffler评分法评估神经功能;TUNEL染色检测神经元凋亡情况;免疫荧光染色检测白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和离子钙结合衔接分子1(Iba1)的表达;Western blot检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平;RT-qPCR检测miR-223-3p的表达水平;利用在线软件TargetScan查询miR-223-3p与NLRP3mRNA中是否存在互补的核苷酸序列。结果:与假手术组比较,BM模型组大鼠的脑膜增厚;神经功能评分明显降低(P0. 05);TUNEL阳性神经元数量明显增多(P0. 05);星形胶质细胞和小胶质细胞被激活;IL-1β和IL-18的免疫荧光强度明显增加(P0. 05);NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β、IL-18和miR-223-3p的表达水平明显升高(P0. 05)。与BM模型组比较,白藜芦醇治疗组大鼠神经功能评分明显升高(P0. 05);TUNEL阳性神经元数量明显减少(P0. 05);星形胶质细胞和小胶质细胞炎症反应被抑制;IL-1β和IL-18荧光强度明显减弱(P0. 05);NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达明显降低,miR-223-3p的表达水平明显上调(P0. 05)。TargetScan查询显示miR-223-3p的部分核苷酸序列与NLRP3 mRNA 3'-UTR的核苷酸序列互补。在白藜芦醇治疗的BM大鼠脑内,与antagomir对照组比较,miR-223-3p antagomir处理组的NLRP3蛋白表达明显升高(P0. 05)。结论:在幼年大鼠BM模型中,白藜芦醇可能通过调节miR-223-3p/NLRP3通路减少皮质神经元炎性死亡,从而发挥对神经元的保护作用。     

CysLT2受体拮抗剂HAMI3379抑制LPS诱导小鼠小胶质瘤细胞系的炎性反应

目的探究半胱氨酰白三烯2(CysLT2)受体拮抗剂HAMI3379对LPS诱导小鼠小胶质细胞(BV-2)炎性反应的调控作用及其可能的作用机制。方法体外培养BV-2,将BV-2分为对照组、LPS(100 ng/mL)组、HAMI3379(0.01、0.1和1μmol/mL)组和LPS+HAMI3379组。CCK-8法检测BV-2细胞的增殖;ELISA检测细胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10的含量;Western-blot检测PKCα、IKBα、NF-κB p50和p65蛋白的表达。结果LPS能够激活BV-2细胞,促进其细胞的增殖(P<0.05);显著增加细胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α的分泌,减少IL-10的分泌(P<0.05);且显著上调PKCα、IKBα、p65蛋白的表达水平(P<0.05)。CysLT2受体拮抗剂HAMI3379能够显著减轻上述变化(P<0.05)。结论CysLT2受体拮抗剂HAMI3379能够抑制LPS激活BV-2细胞,抑制炎性反应,其作用机制可能与抑制PKCα/NF-κB信号通路有关。