HCV 5′NCR和结构蛋白编码序列的克隆及对PA317细胞的转染

目的进一步研究丙型肝炎病毒５′ＮＣＲ对结构蛋白编码基因的表达调控。方法以拼接好的ＨＣＶ５′ＮＣＲ，Ｃ，Ｅ１和Ｅ２／ＮＳ１区基因共长２５４７个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体ＬＮＳＸ得重组体ｐＬＨＣ２５４７，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法把经鉴定的重组体转染入ＰＡ３１７细胞，用Ｇ４１８进行克隆筛选，以ＮＩＨ３Ｔ３细胞测其病毒滴度。提取转染细胞ＤＮＡ及培养上清ＲＮＡ分别用ＰＣＲ和逆转录ＰＣＲ进行鉴定。结果培养上清的病毒滴度为２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，ＰＣＲ及逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分别可以从转染的细胞ＤＮＡ及培养上清中扩增出ＨＣＶ的基因片段。结论目的基因已整合到细胞的基因组中并得以表达     

狼疮ds-DNA抗体VL基因的突变可能影响抗体的致病性

目的 通过ＳＬＥ病人ｄｓ－ＤＮＡ抗体轻链基因的序列测定和分析,研究致狼疮肾炎抗体的轻链基因突变特点及与疾病的关系。方法 本实验室首先建立了狼疮肾炎病人单链抗体文库,并筛选了产生ｄｓ－ＤＮＡ抗体的噬菌体株ＮＹＥ３,用ＡＢＩ３７３型ＤＮＡ测序仪对其ＶＬ基因进行了测定。结果 ＳＬＥ病人ｄｓＤＮＡ抗体轻链基因的互补决定区（ＣＤＲ）存在很多突变。结论 ｄｓＤＮＡ抗体轻链基因的ＣＤＲ区带正电荷氨基酸的突变,可     

丙型肝炎病毒NS5b区与5'-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５ｂ区与５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）不同基因区ＲＮＡ检测结果的区别及临床应用价值。利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测１４８例肝炎患者血清ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因的ｃＤＮＡ,并与５’－ＮＣＲ基因区ｃＤＮＡ检测技术进行了比较。结果 ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因区ＲＮＡ检出率为２４．３％（３４／１４８）,５’－ＮＣＲ基因区ＲＮＡ检出率为３１．１％（４７／１４８）。Ｈ     

HBV DNA及HBxDNA亚片段在肝癌细胞内的整合及作用

为探讨ＨＢＶＤＮＡ及其亚基因片段ＨＢｘＤＮ在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）中整合特点用机制，制备了地高辛标记的３．２ｋｂＨＢＶＤＮＡ全基因及０．５９ｋｂＨＢＶＤＮＡ／ＢａｍＨＩ，ＢｇｌⅡＢＨｘＤＮＡ亚基因探针。点杂交、原位杂交及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测ＨＢＶＤＮＡ的存在情况，筛选ＨＢＶＤＮＡ纯整合标本，以ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢｘＤＮＡ在ＨＣＣ染色体的整合。结果显示ＨＢＶＤＮＡ在肝细胞内以核型为主（７０％）     

HBV.CP—β—IFN真核表达载体的构建及鉴定

目的 扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,将其与β－干扰素基因进行连接,以构建真核表达载体,为下一步研究表达打下基础。方法 ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,产物经ＤＮＡ自动测序正确后,与表达干扰素的ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ质粒进行粘端连接,并对构建真核表达载体进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果 扩增出ＨＢＶ,ＣＰ,序列与报告资料基本一致;与ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ真核表达载体。     

重组丙型肝炎病毒基因转染H9细胞模型的建立

目的：建立重组ＨＣＶ基因转染的Ｈ９细胞（人ＣＤ４，Ｔ细胞）模型。方法：以载体ＣＤＺ２（连接有１６９３ｂｐＨＣＶＤＮＡ，包括完整的ＨＣＶ结构区）为模板，通过ＰＣＲ获得高保真的１．７３ｋｂＤＮＡ片段（包括１６９３ｂｐＨＣＶｃＤＮＡ和部分载体ＤＮＡ序列），其特异性被ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实。将ＨＣＶｃＤＮＡ片段插入载体ｐＣＤ－ＳＲα，经菌落原位杂交以及酶切分斤和ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｏＩｔ筛选，获得重组ＨＣＶ（ｐＣＤ－ＨＣＶ），并与ｐＳＶ２－ｇｐｔ载体共转染Ｈ９细胞。结果：从选择性培养基中筛选口阳性克隆细胞，经ＲＴ－ＰＣＲ．ｄｏｔＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证表明ｐＣＤ－ＨＣＶ在Ｈ９细胞中可进行复制、转录和表达，表达的约１．３×１０５大小蛋白具有ＨＣＶ抗原性。转染ｐＣＤ－ＨＣＶ的细胞培养至９０天时，仍可检测到ＨＣＶｍＲＮＡ和ＨＣＶ抗原。结论：建立ｐＣＤ－ＨＣＶ转染的Ｈ９细胞模型获得成功。     

血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究

目的探讨血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因治疗犬闭塞性血管病的可行性，并对其安全性进行初步观察。方法构建了重组ＶＥＧＦ基因的真核表达载体。在基因转移前３天，肌肉内注射肌肉再生剂丁哌卡因（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ），并通过基因缝线和直接注射法，向血管闭塞症犬（ｎ＝５）的肌肉内转移重组ＶＥＧＦ基因（０．５ｍｇ／ｋｇ），应用ＲＴ－ＰＣＲ技术观察ＶＥＧＦ基因的表达，通过血管造影观察ＶＥＧＦ基因导入犬体内的生物效应；并应用临床自动血液生化分析仪和眼底镜进行转基因的安全性观察。结果转ｐｃＤＮＡ３／ＶＥＧＦ基因２８天后，缺血区肌肉组织内ＶＥＧＦ的表达明显高于对照单纯转ｐｃＤＮＡ３组；１４天后血管造影可见明显新生血管和侧枝循环的形成，２８天后更明显，一年后未见血管无限制生长；血液生化测定未见明显副作用。结论肌肉内转移ＶＥＧＦ基因通过促进血管新生和侧枝循环建立，促进血流恢复，经一年连续观察，无明显毒副作用，为闭塞性血管病的治疗，提供一种新的有效方法。     

HCV5‘NCR和结构蛋白编码序列的克隆及对PA317细胞的转染

目的 进一步研究丙型肝炎病毒５‘ＮＣＲ对结构蛋白编码基因的表达调控。方法 以拼接好的ＨＣＶ５’ＮＣＲ〈Ｃ，Ｅ１和Ｅ２／ＮＳ１区基因共长２５４７个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体ＬＮＳＸ得重组体ｐＬＨＣ２５４７，用聚合酶锭反应（ＰＣＲ）及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法把经鉴定的重组体转染入ＰＡ３１７细胞，用Ｇ４１进行克隆筛选，以ＮＩＨ３Ｔ３细胞测其病毒滴度，提取转染细     

福建肝癌细胞EBV感染与HBV及P53蛋白表达的关系

目的探讨肝细胞癌（ＨＣＣ）中ＥＢＶ与ＨＢＶ感染的相关性及ＥＢＶ与Ｐ５３蛋白表达的关系．方法采用原位杂交技术以地高辛标记的单链ｃＤＮＡ探针、生物素标记的双链ｃＤＮＡ探针及免疫组化ＳＰ法检测ＨＣＣ５９例（含癌旁肝组织）和９例肝硬变组织中高拷贝数ＥＢＥＲ１（ＥＢＶ编码的小ＲＮＡ）、ＨＢＶＤＮＡ和Ｐ５３蛋白．结果肝癌细胞核内ＥＢＥＲ１阳性率为２０３％,显著高于癌旁肝组织（Ｐ＜００１）．肝癌组织内ＨＢＶＤＮＡ阳性率为５９３％,ＥＢＶ存在与ＨＢＶ感染无明显相关性（Ｐ＞００５）．肝癌组织内Ｐ５３蛋白表达率为３３９％,Ｐ５３表达与ＥＢＥＲ１无显著关系（Ｐ＞００５）．结论肝癌细胞内ＥＢＶ感染与ＨＢＶ存在无明显关系,肝癌中Ｐ５３表达与ＥＢＥＲ１无关     

丙型肝炎病毒结构区抗原联合基因重组体DNA免疫的实验研究

目的 试图通过ＤＮＡ免疫的方法进行改进达到增强免疫效率及改变免疫的答类型。方法：应用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区基因重组体（ｐＣ和ｐＣＥ１Ｅ２）与白细胞介素（ＩＬ－２）ｐ３５和ｐ４０编码基因重组体（ｐＩＬ－１２），转染真核细胞并对其表达产物进行检测，并且将ｐＣ、ｐＣＥ１Ｅ２和ｐＩＬ－１２联合免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，对其体液免疫和体内、体外细胞免疫应答进行检测。结果 所构建的重组体均可在真核细胞内瞬时或     

Coxsackie B3病毒诱导人心肌细胞凋亡

体外培养胎儿心肌细胞，待细胞贴壁成层时接种Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ３病毒（ＣＶＢ３），２４小时后收集细胞。应用电镜、ＤＮＡ凝胶电泳分析及原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测发现，感染病毒心肌细胞每视野均有７０％以上呈阳性染色，ＤＮＡ凝胶电泳出现“梯状带”；对照细胞呈现阳性染色者每视野不超过５％，ＤＮＡ凝视电泳只见一条正常基因组ＤＮＡ带。实验结果提示，ＣＶＢ３可诱导体外培养人心肌细胞的凋亡。     

维生素D受体作用的分子基础

维生素Ｄ受体（ＶＤＲ０是由６个功能区组成，每个功能区分工不同但又相互协调。配体结合区介导屯１，２５（ＯＨ）２Ｄ３结合并与视黄酸Ｘ受体形成异二聚体，ＤＮＡ结合区则通过两个锌指结构选择性地识别靶基因上ＤＲ３型维生素Ｄ反应元件（ＶＤＲＥ）并由此改变局部ＤＮＡ的构象，在其他雷同转录激活／抑制因子和ＡＦ－１、ＡＦ－２两个亚区的共同参与下激活转录过程，进行基因表达。在这一过程中，磷酸化对ＶＤＲ转录活性的意义目     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒前C区基因突变与干扰素的关系

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ前Ｃ和部分Ｃ区基因，快速检测ＨＢＶ前Ｃ终止密码突变方法，对慢性乙型肝炎患者干扰素治疗与ＨＢＶ前Ｃ突变关系作了初步研究。６例干扰素治疗后４例ＨＢＶＤＮＡ转阴，２例阳性者均检出突变株。１１例非干扰素治疗者中，检出突变株３例。１例干扰素治疗１个月后ＨＢＶｅ抗累（ＨＢｅＡｇ）转阴，优势病毒株已由突变株与野生株共存状态替代原有野生株，提示干扰素治疗后ＨＢｅＡｇ转阴并不意味着ＨＢＶ被清除，而有潜在ＨＢＶ前Ｃ突变的可能。     

外周血免疫活性细胞姐妹染色体交换与乙肝临床关系的研究

本文以６０名不同类型的乙肝病人为对象，另设２０名正常对照，采用Ｂｒｄｕ标记法测定外周血免疫活性细胞（ＰＢＩＣＣｓ）姐妹染色体交换（ＳＣＥ）率，同时采用ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ技术检测细胞中ＨＢＶＤＮＡ。结果：１．不同类型的乙肝患者ＰＢＩＣＣｓ的ＳＣＥ率均较正常对照显著升高（ｐ＜０．０１）。２．按不同病程的乙肝患者分组，病程长于半年患者ＳＣＥ率均较病程短于半年者为高（ｐ＜０．０１）。３．ＰＢＩＣＣｓ中ＨＢＶＤＮＡ检出率为３０％，检出的ＨＢＶＤＮＡ有整合型、游离型等多种形式，乙肝病毒检出者与未检出者之间，ＰＢＩＣＣｓ中ＳＣＥ率呈高度显著差异（Ｐ＜０．００１）。     

口服丙型肝炎复合多表位DNA减毒鼠伤寒沙门活菌苗的实验研究

目的　利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体,探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） 口服ＤＮＡ 疫苗的可行性。方法　把ＨＣＶ 复合多表位抗原基因ＰＣＸ 克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３（ＣＭＶ 启动子） ,构建ＨＣＶ 真核表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ,转化减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１ ,获得ＨＣＶ 重组口服ＤＮＡ 活菌苗ＳＬ３２６１ （ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） ,免疫小鼠及家兔后,检测特异性免疫应答及安全性。结果　ＳＬ３２６１（ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） 在小鼠及家兔中均可诱发低水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答,免疫动物未见明显的毒性反应。结论　ＨＣＶ 口服减毒鼠伤寒沙门菌ＤＮＡ 疫苗可诱发特异性的免疫应答,为ＨＣＶ 疫苗的研究提供新的理论及实验依据     

上海地区Ⅱ、Ⅲ型丙型肝炎病毒包膜区cDNA序列分析

目的 分析上海地区丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｗ,ＨＣＶ）Ⅱ、Ⅲ型包膜区ｃＤＮＡ序列变异。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增ＨＣＶ包膜区Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１片断（１ ００５ｂｐ）,在３７３ＤＮＡ全自动测序仪上进行了序列分析。结果 ＨＣＶ－Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１区核苷酸和氨基酸同源性比较显示：上海株Ⅱ型、Ⅲ型间同源性分别为６２．４８％和５９．１０％;上海株与加内外同型株间     

应用原位杂交法探讨肠道病毒感染与扩张型心肌病的关系

作者从含柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）ｃＤＮＡ重组质粒（ｐＧＰ５１Ｂ）的大肠菌中提取、纯化ＣＶＢ３ｃＤＮＡ片段，用缺口平移法将Ｂｉｏ１１－ｄＵＴＰ掺入目的基因，制备ＣＶＢ３ｃＤＮＡ探针。通过原位杂交技术检测了４０例组织学诊断为扩张型心肌病的心肌活检标本，并以５例正常心肌标本作阴性对照。结果４０例心肌活检标本中有１８例与该探针杂交出现阳性结果，５例正常对照心肌标本杂交均为阴性，从而确定扩张型心肌病的心肌     

地高辛标记探针原位杂交检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA

用地高辛标记ＨＣＶ５′－ＮＣ区ｃＤＮＡ探针原位杂交检测了２４例ＨＣＶ感染的慢性肝病患者肝组织中ＨＣＶＲＮＡ。结果：１７例同时血清抗ＨＣＶ（ⅡＥＬＩＳＡ法）和ＨＶＣＲＮＡ（套式ＰＣＲ法）均阳性病人中，１４例（８２．３％），肝组织检出了ＨＣＶＲＮＡ。７例仅有抗ＨＣＶ阳性病人，肝组织中没有检出ＨＣＶＲＮＡ。ＨＣＶＲＮＡ特异性信号主要位于肝细胞浆。感染ＨＣＶ的肝细胞呈散在，灶状或弥漫形式分布，与ＡＬＴ水平     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

PCR技术诊断巨细胞病毒宫内感染的临床价值

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法对６６例血清抗居细胞病毒抗体ＩｇＭ（ＣＭＶ－ＩｇＭ）阳性孕妇的新生儿脐血进行了巨细胞病毒脱氧核糖核酸（ＣＭＶ－ＤＮＡ）与ＣＭＶ－ＩｇＭ检测。结果显示，其ＣＭＶ－ＤＮＡ阳性率明显高于ＣＭＶ－ＩｇＭ阳性率，差异非常显著。表明用ＰＣＲ技术检测胎儿脐血ＣＭＶ－ＤＮＡ有助于巨细胞病毒（ＣＭＶ）宫内感染的早期诊断，且ＣＭＶ宫内感染影响胎儿发生发育