整合素连接激酶介导的高糖诱导肾小管上皮细胞纤连蛋白的表达

目的 观察在高糖刺激下纤连蛋白（FN）与整合素连接激酶(ILK) 在肾小管上皮细胞的表达情况，探讨糖尿病肾病小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株（HKC）细胞和链脲佐菌素（STZ）诱导的CD-1小鼠糖尿病动物模型为研究对象，采用Western印迹的方法检测细胞或肾组织ILK和FN蛋白的表达。通过基因转染的方法，将含无激酶活力的人ILK基因表达质粒pCMV-kdILK转染HKC细胞，观察抑制ILK活力对高糖诱导的HKC合成FN的影响。 结果 STZ注射后4周，CD-1小鼠血糖水平显著高于对照组[(20.3±2.7) mmol/L比 （6.1±1.4） mmol/L，P < 0.01]，同时，肾组织ILK和FN的表达量亦显著高于对照组，且ILK与FN表达量呈正相关(P < 0.01)。细胞培养实验证实，高糖能够刺激HKC上调ILK和FN蛋白的表达，并且呈时间和剂量依赖性。HKC细胞转染pCMV-kdILK质粒以抑制ILK的活力，能够显著地拮抗高糖刺激HKC表达FN的作用。 结论 高糖通过上调ILK蛋白增加肾小管表达并合成FN，抑制ILK能够拮抗高糖刺激HKC合成FN的作用。     

高糖通过转化生长因子β1-Smad信号传递途径诱导肾小管上皮细胞转分化

目的 通过观察高糖对肾小管上皮细胞转分化(EMT)的作用，探讨其与转化生长因子β1 (TGF-β1)的关系及糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株HKC细胞和高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株为研究对象。蛋白印迹法检测高糖(葡萄糖浓度分别为25和50 mmol/L)对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白 (E-cadherin)和纤连蛋白(FN)表达的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测TGF-β1的水平。Boyden小室检测HKC细胞的迁移能力。抗TGF-β1抗体中和实验分析高糖对肾小管EMT作用及与TGF-β1的关系。 结果 持续的高糖作用(96 h)能够导致HKC表达α-SMA蛋白，其中25和50 mmol/L的葡萄糖分别增加表达α-SMA 2.8倍和8.2倍；降低E-cadherin的表达；刺激合成FN。25和50 mmol/L的葡萄糖刺激HKC 12 h后，细胞培养上清液中TGF-β1浓度分别为(408.5±198.6)和(939.3±311.8) ng/L，呈剂量依赖性。抗TGF-β1抗体能够显著抑制高糖导致的HKC高表达α-SMA蛋白和FN及降低E-cadherin表达的作用。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖的持续作用下，不能表达α-SMA和FN蛋白，E-cadherin也未见降低。细胞迁移实验表明，25和50 mmol/L高糖能够增加HKC迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[(12.4±3.7)和（18.6±4.4)细胞/HP）]，与正常对照组[(3.0±0.8)细胞/HP]差异有统计学意义(P < 0.01)。抗TGF-β1多克隆抗体能够部分抑制高糖(50 mmol/L)造成的HKC细胞向Boyden小室膜下侧面的迁移[(11.9±5.2)细胞/HP]。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖培养条件下迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[（4.3±1.2）细胞/HP]与正常对照组差异无统计学意义。 结论 高糖能够诱导肾小管EMT，此作用与高糖刺激该细胞合成TGF-β1有关，阻止Smad信号途径能够拮抗TGF-β1介导的肾小管EMT的作用。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ODN)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)mRNA表达和蛋白产生的影响,以明确CTGF在肾脏细胞外基质(ECM)降解中的作用。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HKC),以脂质体介导方法将CTGF反义ODN转染细胞。以TGF-β1(5μg/L)刺激HKC不同时间后,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测PAI-1mRNA表达;流式细胞仪法检测胞内PAI-1蛋白合成;Western印迹方法检测HKC分泌到上清中的PAI-1蛋白含量。结果TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和PAI-1。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制TGF-β1诱导的HKCPAI-1mRNA表达。转染后24h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内PAI-1蛋白合成,并减少了HKC分泌到胞外的PAI-1。结论CTGF在肾小管间质纤维化时ECM降解中起了关键调控作用,其反义ODN的导入可能是延缓肾小管间质纤维化的有效手段之一。     

黄芪通过c-met调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

AB 目的：探讨黄芪对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的作用及机制。方法：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,应用倒置相差显微镜观察NRK52E细胞形态学变化;免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,肝细胞生长因子HGF受体（c-met）的表达;ELISA法定量检测细胞上清液中胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）,胶原Ⅲ（Col-Ⅲ）和纤维黏连蛋白（FN）的水平。结果：TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（TEMT）,TGF-β1诱导组细胞肥大、拉长,呈长梭形,α-SMA表达明显增强,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌增加（P〈0.05）。加入不同浓度黄芪后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌均较TGF-β1诱导组明显抑制（P〈0.05）,c-met表达较TGF-β1诱导组增加（P〈0.05）且呈剂量依赖性。结论：TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质成分Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的分泌;黄芪能够抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化以及细胞外基质的分泌;黄芪抑制细胞转分化的机制可能与其增强c-met的表达有关。     

姜黄素对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质成分的影响

目的：通过研究姜黄素（curcumin,Cur）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化及分泌细胞外基质（ECM）成分的影响,探讨姜黄素在防治肾小管-间质纤维化方面可能的作用机制。方法：应用不同浓度Cur处理经TGF-β1诱导活化的HK-2细胞,通过显微镜观察细胞形态改变,免疫组化技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达;应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的分泌。结果：（1）正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强;（2）不同浓度Cur组与单纯TGF-β1刺激组相比α-SMA的表达有所减弱,而E-cadherin的表达增强;（3）不同浓度Cur抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与单纯TGF-β1刺激组相比有统计学差异（P〈0.05）。结论：姜黄素能抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质成分ColⅠ、ColⅢ和FN的合成,在一定程度上具有防治肾小管-间质纤维化的作用。     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

红细胞生成素对高糖诱导下肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）对高糖诱导下的肾小管上皮细胞转分化的影响。 方法 体外培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,分为正常对照组、渗透浓度对照组、高糖组、高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组。RT-PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smads信号蛋白2（Smad2）及整合素连接激酶（ILK）的mRNA表达。细胞免疫荧光法检测细胞TGF-β1及α-SMA的蛋白表达。 结果 RT-PCR结果显示,相对于对照组,高糖组细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、ILK的mRNA表达均显著上调（P ＜ 0.01）。细胞免疫化学也显示,高糖组TGF-β1和α-SMA的蛋白表达较对照组显著上调（P ＜ 0.01）,而高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组上述指标的表达均显著低于高糖组（均P ＜ 0.01）。 结论 EPO能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,可能与其抑制TGF-β1、Smad2及ILK表达有关。     

糖尿病大鼠肾小管整合素连接激酶的表达及氯沙坦的干预作用

目的：观察糖尿病大鼠肾小管上皮细胞整合素连接激酶（ILK）的表达以及氯沙坦对其的影响。方法：雄性Wistar大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型,随机分为模型组和氯沙坦组;另设正常组腹腔注射缓冲液。第8周、第16周测24h尿蛋白定量和血肌酐,处死大鼠,取肾组织行HE、Masson染色,观察肾脏病理改变;免疫组化法检测大鼠肾小管上皮细胞ILK、TGF-β1的表达。结果：模型组大鼠肾小管上皮细胞胞浆ILK表达增高,与小管间质病变程度一致;同时TGF-β1表达亦增高,并与ILK表达呈正相关性。氯沙坦组大鼠尿蛋白较模型组明显减少,肾小管间质病变减轻,肾小管上皮细胞ILK、TGF-β1表达明显减弱。结论：糖尿病大鼠肾小管上皮细胞存在有ILK的高表达,ILK的表达强度与肾小管间质损伤程度相一致,并与TGF-β1的表达呈正相关;氯沙坦能下调肾小管上皮细胞ILK的表达。     

益肾泄浊方对TGF-β_1诱导大鼠肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原及FN表达的影响

目的：探讨益肾泄浊方对TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原及FN表达的影响。方法：采用灌胃法分别给予健康大鼠益肾泻浊方冲剂、缬沙坦以及益肾泻浊方＋缬沙坦联合治疗,取给药后大鼠的血清分组干预经TGF-β1刺激72h后的大鼠肾小管上皮（NRK52E）细胞,用RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、FNmRNA的表达,用ELISA方法检测FN蛋白水平的表达。结果：益肾泻浊方、缬沙坦均能抑制TGF-β1诱导的NRK52EⅠ型胶原、FN的表达,而益肾泻浊方与缬沙坦联用后,对NRK52E细胞FN表达的抑制作用更为显著。结论：益肾泻浊方抑制TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原及FN的表达,可延缓肾脏纤维化的进展。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

肝细胞生长因子下调Smurf2拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化

目的 通过观察肝细胞生长因子( HGF)对正常大鼠肾上皮细胞(NRK-52E)转化生长因子β1( TGF-β1)诱导的Smad泛素化调节因子2(Smurf2)表达的影响,探讨HGF拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)的分子机制.方法 以NRK-52E细胞为研究对象,给予TGF-β1(5μg/L)处理0～24 h;或部分细胞经HGF(20 μg/L)预处理30 min后,再予TGF-β1(5μg/L)处理1h或48 h;另外部分细胞予以Smurf2质粒表达载体或Smurf2 siRNA 转染24 h后,再予HGF处理24 h.应用Western印迹及间接免疫荧光染色方法检测Smurf2、SnoN、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(FN)的表达.结果 与对照组相比,TGF-β1处理后迅速上调NRK-52E细胞中Smurf2蛋白表达(P＜0.01);同时显著诱导FN和α-SMA蛋白表达,并下调E-cadherin表达.而予HGF预处理细胞后,可快速抑制TGF-β1诱导的Smurf2表达上调(P＜0.01);并逆转TGF-β1介导的SnoN(P＜0.01)、E-cadherin(P＜0.05)、α-SMA(P＜0.01)和FN(P＜0.01)表达变化.此外,在NRK-52E细胞中过表达Smurf2蛋白可部分抑制HGF诱导的SnoN蛋白上调;而抑制Smurf2表达则可进一步促进HGF诱导的SnoN蛋白表达.结论 在肾小管上皮细胞中,HGF可能通过下调Smurf2表达抑制SnoN蛋白发生泛素-蛋白酶体依赖性降解,进而拮抗TGF-β1介导EMT形成.     

PTEN编码蛋白对TGF-β1刺激大鼠肾成纤维细胞增殖和ColⅣ与FN分泌的抑制作用

目的：观察张力蛋白同源物基因（PTEN）编码蛋白对转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激所致大鼠肾成纤维细胞增殖和Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤连蛋白（FN）分泌的影响。方法：用重组PTEN腺病毒转染体外培养大鼠肾成纤维细胞,倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测PTEN mRNA表达。转染36h后TGF-β1体外刺激,TGF-β1刺激24h后MTT法检测细胞增殖活力,免疫细胞化学法检测PCNA表达,ELISA法检测细胞上清中ColⅣ、FN水平。结果：PTEN腺病毒转染36h后可见明显绿色荧光蛋白表达,PTEN mRNA表达明显增多（P〈0.01）。PTEN腺病毒转染后给予TGF-β1刺激组较单纯TGF-β1刺激组平均光密度值（OD）显著降低（P〈0.01）,PCNA表达显著减少（P〈0.01）,且ColⅣ、FN的分泌水平明显下降（P〈0.05）。结论：PTEN基因编码蛋白能抑制TGF-β1刺激所致大鼠肾成纤维细胞增殖、PCNA表达及ColⅣ、FN分泌,可能具有抑制残肾纤维化、延缓残肾毁损速度的作用。     

缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞整合素连接激酶表达的影响

目的：观察缬沙坦对糖尿病肾病（DN）大鼠肾小管上皮细胞整合素连接激酶（ILK）表达的影响，探讨缬沙坦肾脏保护作用的可能机制。方法：30只Wistar雄性大鼠随机分为正常组（n=10）、模型组（n=10）和干预组（缬沙坦30mg·kg^-1·d^-1，n=10）。第8、16周每组各处死5只大鼠，观察大鼠肾脏病理改变以及免疫组化方法检测其肾小管上皮细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）、ILK的表达并作半定量分析。结果：（1）DN大鼠肾小管上皮细胞ILK与TGF-β1同向表达增高，随病程进展递增；（2）缬沙坦干预后大鼠肾小管上皮细胞ILK表达较模型组显著降低。结论：（1）DN大鼠肾小管上皮细胞ILK与TGF-β1同向表达增高，提示ILK是肾间质纤维化发展的一个重要因素；（2）缬沙坦可能通过下调ILK来改善肾间质纤维化病变而发挥肾脏保护作用。     

Lefty蛋白拮抗人肾小管上皮细胞凋亡的研究

目的 探讨Lefty蛋白对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡的影响。方法采用脂质体将人Lefty质粒转染入离体培养的HK-2细胞,使其稳定表达Lefty蛋白。对正常对照组（A组）和Lefty转染组（B组）细胞给予10ng／mlTGF-β1刺激后,采用Westernblot法检测各组细胞第6、12、24、48小时磷酸化Smad2／3（p-Smad2／3）表达水平,并同时采用流式细胞术检测各组细胞凋亡程度。结果TGF131刺激后,A组p-Smad2／3表达水平和细胞凋亡程度较刺激前升高（P〈0．05）,而B组上述指标均低于A组（P〈0.05）。结论Lefty蛋白可拮抗TGF-19J／Smad信号转导通路,减轻TGF-β1介导的人肾小管上皮细胞凋亡。     

间隙连接蛋白43表达改变对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）过程中间隙连接蛋白43（connexin 43）表达和细胞间通讯功能的变化,以及上调connexin 43水平对TEMT的影响。方法 用转化生长因子（TGF）β1刺激人肾小管上皮细胞系（HKC）,检测connexin 43、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和肌成纤维细胞标志物α-SMA、vimentin的表达。用激光共聚焦显微镜荧光漂白恢复（FRAP）技术检测HKC细胞间通讯功能。通过pLNCX2- connexin 43病毒质粒转染HKC上调connexin 43的表达,检测以上各指标的变化,观察对TEMT的影响。结果 HKC经TGF-β1刺激后．其α-SMA和vimentin mRNA和蛋白质表达增强,而E-cadherin和connexin 43表达下降（P＜0．05）,细胞间通讯功能降低（P＜0．05）。connexin 43高表达后,TEMT程度明显减轻。结论 上调肾小管上皮细胞间通讯功能可部分减轻TEMT程度。     

糖肾宁对高糖培养肾近端小管上皮细胞FN分泌及TGF-β1 mRNA表达作用

目的研究中药复方糖肾宁对高糖诱导的肾近端小管上皮细胞转化生长因子β1（TGF-β1）表达和分泌纤维连接蛋白（FN）的影响,探讨其治疗糖尿病肾病（DN）的机制。方法分别采用RT-PCR和ELISA方法检测不同时间下高糖对肾近端小管上皮细胞TGF-β1 mRNA表达和分泌FN的作用,及糖肾宁药物血清对上述指标的影响。结果高糖呈时间依赖性增加肾小管上皮细胞TGF-β1 mRNA表达,高糖培养24h后细胞分泌FN也明显增多,加入糖肾宁药物血清后上述指标均有下降（P〈0．05）。结论糖肾宁抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1和FN表达可能是其治疗DN的分子机制之一。     

银杏叶提取物在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞表型转化中的作用研究

目的：揭示银杏叶提取物（EGb）在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HKC）表型转化中的作用,并探讨其对单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法：体外培养HKC,经TGF-β1、EGb干预后,应用细胞免疫组化ABC法检测细胞角化蛋白-18与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达,应用实时定量RT-PCR及Western blot。检测Ⅰ型胶原蛋白,应用Western blot方法检测MCP-1表达。结果：TGF-β1（8ng/ml）刺激HKC细胞72h后,细胞角化蛋白-18表达明显下调,α-SMA、Ⅰ型胶原、MCP-1表达明显上调;加入EGb25、50、100、150mg/L干预72h后,α-SMA、Ⅰ型胶原和MCP-1表达呈剂量依赖性减少,细胞角化蛋白-18表达呈剂量依赖性增加。结论：EGb以浓度依赖性方式抑制TGF-β1诱导的HKC表型转化,该作用机制可能与EGb下调MCP-1基因表达有关。     

转化生长因子β1短发夹RNA对白蛋白刺激人肾近曲小管上皮细胞细胞因子表达的影响

目的 研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）对人血清白蛋白（HSA）致人肾近曲小管上皮细胞（HK2细胞）增殖，TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）和纤连蛋白（FN）表达的影响，并探讨有关机制。方法 构建TGF-β1shRNA的pcDU6载体质粒，体外培养HK2细胞株。采用脂质体转染将表达TGF-β1shRNA的pcDU6质粒载体（pcDU6-A1-A2和peDU6-B1-B2）分别导人实验组细胞。用HSA（5g／L）刺激HK2细胞12h或24h。四甲基偶氮唑盐（MTF）比色法测定细胞增殖水平。RT-PCR半定量分析HK2细胞中TGF-β1、CTGF和FNmRNA的表达水平；双抗夹心酶联免疫吸附法检测HK2细胞培养液中TGF-β1及FN蛋白质水平。结果 HK2细胞在HSA刺激下，其TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显上调，培养液中TGF-β1和FN的蛋白质含量亦明显升高（P〈0．05）。与pcDU6空载体组比较，pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA干扰组TGF-β1、CTGF及FNmRNA的表达明显下调（P〈0．05）。TGF-β1shRNA转染HK2细胞后12h或24h，细胞培养液中TGF-β1和FN蛋白质含量明显下降，HK2细胞增殖被部分抑制（P〈0．05）。在细胞增殖、TGF-β1、CTGF及FN基因表达方面，TGF-β1shRNA干扰组组间比较，以及pcDU6空载体转染组与HSA刺激组比较，差异均无统计学意义。结论 peDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制HSA刺激下HK2细胞增殖、TGF-β1、CTGF和FN基因的表达。HSA刺激HK2细胞增殖及CTGF和FN基因的过表达可能通过TGF-β1介导。     

黏着斑激酶在转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化（EMT）过程中黏着斑激酶（FAK）的表达及下调FAK的表达后对TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、FAK mRNA和蛋白的表达及磷酸化（p）-FAK（Tyr397）的蛋白表达。应用Lipofectmine2000将FAK siRNA转染HK-2细胞,采用Western印迹观察下调表达FAK对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后,HK-2细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。FAK蛋白和mRNA随时间的延长表达逐渐增多,48 h达到高峰。p-FAK（Tyr397）蛋白表达趋势与FAK相同。脂质体转染siRNA后FAK的mRNA和蛋白分别下调了50%和41%,下调表达FAK后可以显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA蛋白的上调表达,逆转 E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程FAK蛋白表达上调,敲低FAK蛋白表达后可以部分减轻EMT的程度,提示FAK在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中发挥一定的作用。     

黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及其机制探讨

目的：探讨黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及甚可能机制。方法：将体外培养的人肾小管上皮（HK-2）细胞株转板至细胞融合并同步后,分为空白对照组、转化生长因子-β（TGF-β1）刺激组（5ng／ml）、TGF-β1加黄芪100μg／ml组、TGF-β1加黄芪1mg／ml组。作用24h后半定量逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测纤维连接蛋白（FN）及纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中FN的含量;westernblot检测PAI-1的表达。结果：（1）HK-2细胞表达少量FN和PAI-1;（2）HK-2细胞在5ng／ml TGF-β1．刺激下分泌FN、PAI—1mRNA及FN、PAI-1蛋白表达明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;（3）HK-2细胞在TGF-β1和不同浓度的黄芪作用后,可使FN、PAI-1mRNA及蛋白表达减少,与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,尤以黄芪1mg／mi组为甚。结论：TGF—β1可促进HK-2细胞分泌FN和PAI—1,黄芪可部分拮抗TGF-β1的上述效应。这可能是黄芪预防或改善肾小管间质病变的作用机制之一。