无血清培养人结肠癌球囊样细胞生物学特性研究

目的 采用无血清培养方法从人结肠癌细胞株中分选出富含肿瘤干细胞的球囊样细胞,并分析其增殖和迁移特性.方法 人结肠癌细胞株HCT116、HT29细胞在特殊配制的无血清培养基(SFM)中悬浮培养,观察球囊样细胞的生成.流式细胞仪检测结肠癌干细胞分子标记CD133表达,利用CCK-8比色法以及Transwell小室法研究结肠癌球囊样细胞的增殖情况和迁移能力.采用成组设计资料的t检验分析检测数据.结果 HCT116、HT29细胞在SFM培养条件下可以获得可稳定传代的球囊样细胞,SFM培养下HCT116球囊样细胞CD133阳性细胞占75.44％±11.41％,HT29球囊样细胞CD133阳性细胞占76.22％±14.23％.与常规含血清培养基(SSM)培养的同系细胞比较,HCT116及HT29球囊样细胞中结肠癌干细胞分子标记CD133阳性细胞数明显增多(t=11.43,9.17,P＜0.05),其持续增殖能力和运动迁移能力均增强.结论 无血清培养获得的结肠癌球囊样细胞高表达结肠癌干细胞分子标记CD133,且具有更强的增殖和迁移能力.它可作为进一步研究结肠癌干细胞的良好模型.     

细胞株源人前列腺肿瘤干细胞的分选与鉴定

目的:论证人前列腺癌(prostate cancer,PCa)细胞株中是否存在干细胞亚群。方法:分别用免疫表型法和侧群(side population,SP)细胞法从5种人PCa细胞株(Du145、IA8、LNCaP、TSU-PrL和PC-3)中富集类干细胞,再应用软琼脂克隆形成试验初步验证类干细胞亚群的体外生长方式及成瘤能力。选择LNCaP源SP细胞(LNCaP/SP),依次采用免疫细胞化学技术、Transwell、MTT以及裸鼠致瘤试验,分别检测其干细胞标记物的表达情况、鉴定其体外增殖和侵袭能力以及动物体内的致瘤和转移潜能。结果:5种细胞株中均难以分选出免疫表型为CD133+CD44+的细胞亚群。除PC-3外,其余4株细胞可分选出呈现典型克隆性生长特点的SP细胞。体外克隆形成率在IA8、LNCaP和TSU-PrL源SP细胞与非侧群(non-side population,NSP)细胞间有显著性差异(P<0.05)。与LNCaP/NSP相比,LNCaP/SP的体外增殖和侵袭能力显著增强,同时阳性表达整合素α2、Nanog、CD44、OCT4以及ABCG2等5种干细胞标记物。而且,LNCaP/SP的皮下成瘤率、骨转移率及瘤体体积亦显著高于LNCaP/NSP(P<0.01)。结论:SP分选法更适合富集人PCa细胞株中类干细胞,LNCaP/SP细胞是PCa细胞株LNCaP中的肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)。     

人前列腺癌细胞系PC-3再表达雄激素受体(AR)的肿瘤生物学特性研究及其意义

目的研究人全长雄激素受体(androgen receptor,AR)cDNA质粒(pSAR-IRES-EGFP)在人进展期前列腺癌细胞系PC-3中稳转染再表达,即人前列腺癌细胞系PC-3-AR~+的肿瘤生物学特性及其干细胞相关基因蛋白表达的变化,探讨AR的分子生物学作用。方法(1)应用体外细胞培养,通过四氮甲基唑氮(MTT)和细胞划痕等方法检测癌细胞生长和迁移特性;Western Blot方法检测干细胞相关蛋白的表达;细胞爬片和免疫荧光方法检测干细胞相关蛋白的定位和表达。(2)应用人前列腺癌细胞组织重组-先天免疫缺陷小鼠(Nude)肾包膜下移植技术,建立人前列腺癌-小鼠移植瘤模型,通过H.E.染色和病理学分析研究癌细胞的成瘤性、浸润和转移能力等肿瘤生物学特性;通过免疫组化染色技术检测移植瘤干细胞相关蛋白的定位和表达。结果人雄激素非依赖型进展期前列腺癌细胞系PC-3再表达全长AR.cDNA,即PC-3-AR+,导致以下情况的改变:(1)体外细胞培养中癌细胞的生长和扩增能力以及迁移特性均受抑制;(2)小鼠体内移植瘤肿瘤体积减小,癌细胞变大,分化增强,坏死增加和浸润能力减低;(3)培养细胞中检测到干细胞相关蛋白CD133、CD44和ALDH等的表达增加。结论人雄激素非依赖型前列腺癌细胞系PC-3再表达全长AR cDNA,使其生长受抑,分化增强,坏死增加和干细胞相关基因蛋白(CD133、CD44和ALDH)的表达增加。     

去甲斑蝥素抑制基质金属蛋白酶-9蛋白表达对前列腺癌PC-3细胞迁移及侵袭力的影响

目的:研究去甲斑蝥素抑制基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达对前列腺癌PC-3细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:将去甲斑蝥素作用于前列腺癌PC-3细胞后,Western-blot和实时荧光定量PCR检测MMP-9表达水平的变化,划痕实验和侵袭实验检测PC-3细胞侵袭力的变化,透射电镜观察PC-3细胞的伪足形态变化。结果:去甲斑蝥素干预组PC-3细胞中MMP-9的mRNA表达量显著低于空白对照组(P<0.05),同时,去甲斑蝥素干预组PC-3细胞中MMP-9的蛋白表达量显著低于空白对照组(P<0.05);迁移与侵袭实验结果显示,去甲斑蝥素干预组PC-3细胞划痕愈合程度较空白对照组显著降低(P<0.05);去甲斑蝥素干预组PC-3细胞侵袭能力显著低于空白对照组(P<0.05),透射电镜观察发现去甲斑蝥素干预组PC-3细胞的伪足较空白对照组明显减少。结论:去甲斑蝥素作用于前列腺癌PC-3细胞后,PC-3细胞的侵袭能力下降,可能与MMP-9蛋白表达水平下降使PC-3细胞的侵袭伪足减少有关。     

不同前列腺癌细胞株Talin-1表达情况和侵袭能力关系研究

目的探讨踝蛋白1(Talin-1)在不同前列腺癌细胞株中的表达情况和侵袭能力的关系。方法体外培养不同人前列腺癌细胞株(DU-145、PC-3、LNCaP)及人正常前列腺上皮细胞株(RWPE-1)。传代培养后利用MTT法检测各细胞株增殖能力。细胞划痕实验,Transwell小室侵袭和迁移实验检测各细胞株侵袭及迁移能力。RT-PCR技术检测各细胞株中Talin-1的mRNA表达水平。Western-blot技术检测各细胞株中Talin-1的蛋白表达水平。结果与RWPE-1细胞株相比,LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株的增殖、侵袭和迁移能力明显增高(P0.05),其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株的增殖、迁移以及侵袭能力依次递增(P0.05)。前列腺癌LNCaP细胞株、PC-3细胞株、DU145细胞株中的Talin-1 mRNA及蛋白表达水平显著高于RWPE-1细胞株(P0.05);其中LNCaP、PC-3、DU-145细胞株中的Talin-1 mRNA以及蛋白表达水平依次递增(P0.05)。结论Talin-1与前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力相关;低表达Talin-1的前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力低,恶性度低;高表达Talin-1的前列腺癌的增殖、侵袭和迁移能力强,恶性度高。Talin-1可作为前列腺癌恶性度的预测指标之一。     

上皮细胞生长因子作用时间对富集结肠癌肿瘤干细胞的影响

目的探讨在上皮细胞生长因子(EGF)作用下,用悬浮培养法富集结肠癌肿瘤干细胞的最佳培养时间。方法在含20 ng/mL EGF的无血清培养基中,悬浮培养人结肠癌DLD-1细胞获取球细胞,设置时间梯度为10 d、20 d、30 d及40 d。采用流式细胞术(FCM)检测球细胞中CD133~+、CD44~+和CD133~+CD44~+细胞的比例;采用成球实验和有限稀释法检测细胞球的自我更新能力,平板克隆形成实验检测细胞体外成瘤能力。结果流式细胞术检测结果显示:30 d组球细胞中CD133~+及CD133~+CD44~+细胞的比例较其他组明显增多(均P0.05),其CD44~+细胞的比例高于20 d组(P0.05),但与另外2组的差异无统计学意义(P0.05)。有限稀释法和平板克隆形成实验中,30 d组或40 d组的数量最高,2组比较差异无统计学意义(P0.05),30 d组与10 d及20 d组比较差异均有统计学意义(均P0.05)。成球实验中,30 d组细胞球自我更新能力较其他组明显增强(均P0.05)。结论在20 ng/mL EGF悬浮培养30 d可最大效率地富集结肠癌DLD-1肿瘤干细胞。     

长链非编码RNA Linc00662促进前列腺癌细胞生长的研究

目的:探讨Linc00662在前列腺癌的表达情况及对前列腺癌细胞生物学功能的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对60例前列腺癌患者的前列腺癌组织标本以及正常前列腺上皮细胞(WPMY-1细胞)和前列腺癌细胞系(DU145、PC-3、LNCaP和22RV1)检测Linc00662的表达,并分析前列腺癌组织中Linc00662表达与患者临床病理特征的相关性。应用RNA干扰(siRNA)转染PC-3和DU145细胞,qRT-PCR验证干扰效率。通过CCK-8、Caspase 3/9活性测定、划痕试验、Transwell侵袭试验分别检测干扰Linc00662的表达对前列腺癌PC-3和DU145细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。结果:与邻近及正常组织前列腺上皮细胞相比,Linc00662在前列腺癌组织和细胞系的表达呈显著上调(P0.01)。Linc00662的高表达与肿瘤分期(P=0.002)、原发灶大小(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.001)及远处转移(P=0.001)呈正相关。si-Linc00662转染PC-3和DU145细胞后,Linc00662的表达明显下降(P0.01)。与对照组相比, Linc00662干扰组在PC-3和DU145细胞中的增殖、侵袭及迁移能力均明显下降(P0.01),而凋亡增加(P0.01)。结论:Linc00662在前列腺癌组织及细胞中呈相对高表达,敲低Linc00662的表达可抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进其凋亡,可作为前列腺癌新的标志物。     

罗格列酮对前列腺癌细胞血管生成拟态的影响秦亮,陈安民,郭风劲,杨卿,任晔,徐飞,廖晖

【】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)对前列腺癌PC-3细胞血管生成拟态的影响。方法 体外培养人前列腺癌PC-3细胞,应用CCK-8法观察罗格列酮不同浓度和不同作用时间对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响;体外建立matrigel三维培养系统,观察罗格列酮对PC-3细胞血管生成拟态( vasculogenic mimicry,VM) 形成的影响;应用RT-qPCR和elisa的方法检测VE-cadherin、ephA2、VEGF mRNA和 VEGF蛋白的表达。结果 罗格列酮在48h后明显抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。前列腺癌PC-3细胞在体外三维培养条件下能够形成形成环状和网络样结构。罗格列酮能够抑制PC-3细胞VEGF、VE-cadherin、ephA2 mRNA及VEGF蛋白的表达,并使其形成血管生成拟态的能力明显降低。结论 罗格列酮可能通过下调前列腺癌细胞VEGF、VE-cadherin、ephA2的表达抑制血管生成拟态形成。     

PIWIL2在人膀胱移行细胞癌肿瘤干细胞样细胞中的表达及意义

目的 研究PIWIL2在人膀胱癌肿瘤干细胞样细胞(CSLC)中的表达和意义,探讨PIWIL2在靶向肿瘤干细胞治疗中的作用.方法 用无血清悬浮培养法从人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87中分离获得悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;分别采用T...     

CD105、CD133在人肝癌细胞株HepG-2的表达情况及生物学性状的体外研究

目的 观察人肝癌细胞株HepG-2中CD105、CD133的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体外研究.方法 采用含10％胎牛血清的DMEM培养HepG-2.流式细胞分选仪检测CD105、CD133表达情况并分选出CD105+ CD133+、CD105-CD133+、CD105+ CD133-、CD105-CD133-亚群.CCK-8和Transwell侵袭实验分别检测各细胞亚群增殖及侵袭能力;软琼脂培养试验检测细胞成球能力.结果 四种不同细胞亚群的比例分别为99.57％,0.2％,0.2％和0.03％.CD133阳性亚群增值能力和成球能力较CD133-及未分选细胞强;而CD105+亚群侵袭能力较CD105-及未分选细胞强.结论 CD105在人肝癌细胞株HepG-2的表达与其侵袭能力有关,CD133与其增殖成球能力有关.CD105+ CD133+亚群在人肝癌细胞株HepG-2中具有干细胞特性.     

3-溴丙酮酸对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:观察3-溴丙酮酸(3-BrPA)对前列腺癌细胞PC-3增殖、迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其内在机制。方法:体外培养PC-3细胞,倒置显微镜下观察不同浓度3-BrPA对PC-3细胞形态学的影响;应用MTT法、细胞划痕和Transwell法检测不同浓度3-BrPA在不同时间段(24、48、72 h)对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响;应用Western印迹检测3-BrPA作用后各组PC-3细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和基质金属蛋白酶14、9、2(MMP-14、MMP-9、MMP-2)蛋白表达的变化。结果:在一定浓度范围内,随着3-BrPA浓度的升高,细胞形态的改变愈明显。MTT结果表明,随着3-BrPA浓度的增加、作用时间延长PC-3细胞抑制率增大(P<0.01)。细胞划痕和Transwell细胞侵袭实验显示:与对照组相比,培养24 h后25、50、100μmol/L 3-BrPA浓度组细胞划痕迁移愈合率降低,细胞侵袭数目减少,且培养48 h与24 h相比,各组细胞迁移愈合率和侵袭细胞数目均降低,表明细胞体外迁移率和侵袭细胞数目与3-BrPA作用浓度、作用时间有关,具有剂量和时间依赖性(P<0.01)。Western印迹检测结果表明:与对照组相比,25、50、100μmol/L 3-BrPA浓度组中GLUT1、MMP-14、MMP-9、MMP-2蛋白表达量明显降低(P<0.01)。结论:糖酵解抑制剂3-BrPA降低PC-3增殖、迁移和侵袭能力,可能与下调GLUT1、MMP-14、MMP-9及MMP-2蛋白表达有关。     

MiR-29a通过调节HuR影响前列腺癌细胞的生物学行为

目的 研究前列腺癌中miR-29a 对HuR表达的调节，进而影响细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡。方法 通过实时荧光定量（qRT-PCR）和免疫印迹法（Western blot）检测在正常前列腺上皮细胞RWPE-1和激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3内miR-29a、人抗原R(HuR) mRNA和蛋白的表达水平；miR-29a mimics(模拟剂)、inhibitor（抑制剂）和NC miRNA(对照剂)转染PC-3细胞48 h后检测miR-29a、HuR mRNA和蛋白的表达水平。细胞增殖试剂盒(CCK-8)、迁移和侵袭实验（Transwell小室）、流式细胞术分别检测PC-3细胞被转染后细胞增殖、迁移侵袭、凋亡的改变。结果 与RWPE-1细胞相比，PC-3细胞中miR-29a的表达下调，HuR mRNA和蛋白的上升（P<0.05）。与对照组相比，miR-29a mimics(模拟剂)、inhibitor（抑制剂）转染PC 3细胞后HuR mRNA无改变，但是能够改变HuR蛋白的表达（P<0.05）。MiR-29a能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡（P<0.05）。结论 在前列腺癌PC-3细胞中，miR-29a通过调节HuR蛋白的表达，进而对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡产生影响。     

胆管癌干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从人胆管癌细胞系QBC-939中分离具有干细胞特征的肿瘤细胞,为后续胆管癌干细胞的研究提供材料。方法:用无血清培养法及流式细胞分选法从QBC-939细胞中分离得到具有干细胞特征的CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞,继续在无血清培养基中培养,观察其成球能力,并比较CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞与QBC-939细胞单克隆形成率、耐药性,增殖能力,干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1、E-cadherin蛋白表达情况,以及BALB/c小鼠皮下移植后的成瘤能力。结果:在无血清培养基中,CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞具有较强的成球能力。与QBC-939细胞比较,CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞克隆形成率、洛铂耐药性、增殖明显增加;干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1表达明显增加,而E-cadherin表达明显降低;皮下移植瘤形成率明显增加。以上差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:从人胆管癌QBC-939细胞中分离的干细胞样细胞具有肿瘤干细胞特性,可用于胆管癌干细胞的研究。     

槲皮素通过G3BP1调控Wnt/β-catenin信号通路对前列腺癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化的影响

目的探讨槲皮素对前列腺癌(PCa)细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(EMT)的影响,并分析其可能机制。方法人前列腺癌细胞(PC-3)随机分为空白对照组及槲皮素低、中、高浓度组,转染GTP酶激活蛋白-Src同源结构域3-结合蛋白1(G3BP1)siRNA及其阴性对照、pcDNA3.1-G3BP1及其阴性对照至PC-3细胞,并用槲皮素处理。分别采用细胞划痕试验和Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测G3BP1 mRNA表达,Western blot法检测G3BP1蛋白、EMT相关蛋白及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路蛋白表达。结果槲皮素抑制PC-3细胞迁移、侵袭,上调E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达,下调N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、转录因子Snail表达;槲皮素下调PC-3细胞G3BP1 mRNA和蛋白表达,下调Wnt家族成员3A(Wnt-3α)、β-catenin、磷酸化糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)表达,上调GSK-3β表达;沉默G3BP1增强槲皮素对PC-3细胞及Wnt/β-catenin通路的作用,过表达G3BP1逆转槲皮素对PC-3细胞及Wnt/β-catenin通路的作用。差异均有统计学意义(P<0.05)。结论槲皮素可通过抑制EMT抑制PCa细胞的迁移、侵袭能力,其作用机制可能与其靶向G3BP1抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。     

靶向沉默维生素D受体基因对前列腺癌细胞迁移及侵袭性的影响

目的:探讨小干扰RNA靶向沉默维生素D受体(VDR)对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响。方法:构建VDR-shRNA慢病毒载体,用RT-PCR和Western印迹法分别检测VDR的mRNA和蛋白表达水平;通过细胞划痕愈合实验和Transwell小室检测VDR被沉默后的PC-3细胞迁移能力和侵袭性的变化。结果:VDR-shRNA质粒显著干扰VDR表达,并成功筛选VDR-shRNA干扰稳定的细胞株;细胞划痕实验结果显示划痕愈合率VDR干扰组为59%明显低于空白对照组73.6%和LV3阴性对照组的77.8%,组间差异有显著性(P0.05),空白对照组和LV3阴性对照组组间差异无显著性(P0.05)。Transwell小室实验显示VDR干扰组透膜细胞数量明显低于空白对照组和LV3阴性对照组约为50%,细胞组间差异有显著性(P0.05),空白对照组和LV3阴性对照组组间差异无显著性(P0.05)。VDR干扰组细胞的迁移和侵袭能力明显低于对照组细胞。结论:VDR基因表达水平能影响前列腺癌细胞的迁移及侵袭能力,VDR低表达可致前列腺癌细胞迁移及侵袭能力下降。     

胆囊癌细胞株GBC-SD类肿瘤干细胞筛选的研究

目的 筛选胆囊癌GBC-SD系中具有干细胞特性的细胞克隆.方法 在肿瘤干细胞培养基加入不同剂量的顺铂悬浮培养GBC-SD,将悬浮细胞收集后注射裸鼠,并持续瘤内注射顺铂,成瘤后取瘤内细胞继续原培养基培养,获得悬浮生长的克隆,分别测定其干细胞标志物(CD133、CD44、CD24)、耐药基因ABCG2细胞株MDR-1和转录因子OCT-4、Nanog的表达.结果 在肿瘤干细胞培养基和顺铂的筛选压力下,GBC-SD细胞能有效形成悬浮生长的克隆球,流式检测结果表明克隆球高表达CD133+(97.6%)、CD44+(77.9%),低表达CD24+(2.3%),同时表达耐药基因ABCG2和MDR-1,定量聚合酶链反应(PCR)及免疫荧光方法检测发现,与普通胆囊癌细胞株GBC-SD比较,克隆球干细胞基因OCT-4、Nanog表达分别增强266、284倍.结论 顺铂结合无血清培养基悬浮培养法筛选GBC-SD,作为一种新的干细胞分选方法,可以分离出具有肿瘤千细胞特征的胆囊癌克隆球.     

Hedgehog-Gli信号通路调控EMT驱动前列腺癌干细胞特性形成的初步实验研究

目的探索上皮间质转化EMT与肿瘤干细胞之间潜在联系及相关机制。方法应用免疫组织化学染色方法检测前列腺癌组织中肿瘤干细胞标志物表达情况。应用Q-PCR及Western blot方法检测分析ARCaPE和ARCaPM细胞中EMT及肿瘤干细胞相关标志物表达水平。应用细胞集落形成实验比较ARCaPE和ARCaPM细胞增殖能力。应用肿瘤克隆球形成实验检测细胞克隆形成和自我更新能力。应用GANT61封闭Hedgehog-Gli信号通路,分析Hedgehog-Gli通路阻断后ARCaPM细胞EMT及干细胞特性的变化。结果 CD44在前列腺癌中表达下调,且与分级相关,高级别(Gleason≥8)前列腺癌组织中下调更明显;Nanog在高级别前列腺癌中有表达增高现象;而CD133在前列腺良性增生中和前列腺癌中均为阴性染色。具有间质细胞样形态的ARCaPM细胞迁移侵袭能力较具有上皮细胞样形态的ARCaPE细胞明显增强,E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、Snail表达增加。ARCaPM细胞中肿瘤干细胞分子标志物表达增高,其增殖及自我更新能力均明显增强。Gli1在ARCaPM细胞中表达增高,Gli抑制剂GANT-61可以有效抑制ARCaPM细胞EMT转化,降低其肿瘤干细胞分子标志物表达水平,抑制其增殖及自我更新能力。结论 Hedgehog-Gli信号通路调控的EMT可驱动前列腺癌细胞肿瘤干细胞特性形成。     

肿瘤干细胞的分离及耐双氧水模型的建立

目的从MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)中培养、分离肿瘤干细胞(cancer stem cells,CST),并研究其对氧化性应激的敏感性。方法将MCF-7细胞在无血清悬浮成球培养基中进行成球悬浮培养,倒置相差显微镜观察细胞形态变化(以MCF-7细胞培养液培养的MCF-7细胞作为对照)。取直径达100μm的CST细胞球(实验组)以及融合度达70%的MCF-7细胞(对照组),采用免疫细胞化学染色法检测CST标志物CD133的表达;取直径达150μm的第3代肿瘤球细胞,采用流式细胞仪检测其CD133阳性率;取直径达150μm的第2代肿瘤球细胞(实验组)以及相应代数的MCF-7细胞(对照组),采用50μmol/L H_2O_2损伤DNA 120 min,采用免疫细胞化学染色方法检测其DNA损伤标志物γH2AX表达。结果倒置相差显微镜观察示,MCF-7细胞最初形态以单细胞贴壁状态生长,经无血清悬浮成球培养基培养后细胞聚集生长,最后形成CST细胞球;而经MCF-7细胞培养液培养的对照MCF-7细胞呈伸展状贴壁生长,不能成球悬浮生长。荧光显微镜观察示,对照组MCF-7细胞CD133为阴性表达,而实验组肿瘤球CD133为阳性表达。流式细胞仪检测示,CST中CD133呈阳性表达,阳性率为92%。倒置荧光显微镜观察示,实验组CST肿瘤球经H_2O_2损伤120 min后,其γH2AX表达较对照组MCF-7细胞明显降低。结论无血清悬浮成球培养基能够从MCF-7肿瘤细胞系培养出成球生长的CST细胞,此类细胞具有很强的抗氧化损伤作用。     

癌相关成纤维细胞外泌体携带微小RNA-20a靶向CX43调控细胞缝隙连接促进PC-3细胞侵袭和迁移

目的探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源外泌体微小RNA(miR)-20a对前列腺癌细胞间通讯连接(GJIC)、侵袭和转移能力的影响及其机制。方法构建CAFs来源近红外荧光蛋白(IRFPs)标记外泌体,以不同浓度(0、10、100、200 mg/L)与PC-3细胞共培养。蛋白质印迹法检测PC-3细胞中CX43蛋白的相对表达水平;荧光漂白恢复技术测定PC-3细胞间缝隙连接功能;Transwell小室侵袭和迁移实验检测PC-3侵袭能力。构建高表达和低表达miR-20a的CAFs,分别与PC-3细胞共培养,检测缝隙链接蛋白43(Connexin 43,CX43)表达、细胞缝隙连接功能、细胞迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告实验验证PC-3细胞中miR-20a与CX43基因是否直接结合。用Student’t检验分析组间差异。结果PC-3细胞的CX43表达水平及细胞缝隙连接功能均随外泌体浓度增加而降低(0.715±0.058、0.544±0.039、0.313±0.028和0.196±0.020,F=19.031,P<0.05),差异有统计学意义。Transwell小室检测结果表明,CAFs来源外泌体促进PC-3细胞迁移[各组每视野穿膜细胞数分别为(176.0±9.2)、(485.0±12.8)、(159.5±9.7)和(198.0±10.5)个,F=11.475,P<0.01]和侵袭[各组每视野穿膜细胞数分别为(150.0±8.4)、(443.0±21.7)、(182.0±11.2)和(153.5.0±10.1)个,F=16.306,P<0.01],差异有统计学意义;增强细胞缝隙连接能抑制此效应(F=14.052,P<0.01;F=14.804,P<0.01)。高表达miR-20a组的PC-3细胞的CX43表达水平(0.126±0.062比0.834±0.103,t=9.430,P<0.05)、荧光恢复率[(25.02±7.85)%比(46.65±6.98)%,t=5.782,P<0.05]均显著低于低表达miR-20a组,但细胞的迁移[(502.5±18.6)个比(128.5.0±9.4)个,t=9.120,P<0.05]和侵袭能力(458.0±16.8比194.5±9.2,t=6.286,P<0.05)均显著高于表达miR-20a组,差异均有统计学意义。双荧光素酶报告实验结果显示,野生型CX43的PC-3细胞中,转染miR-20a的细胞荧光活性显著低于miR-NC组(0.46±0.08比0.99±0.14,t=10.208,P<0.05),差异有统计学意义;而突变型CX43的PC-3细胞中,miR-20a组与miR-NC组细胞荧光活性差异无统计学意义(0.94±0.06比0.97±0.08,t=0.142,P>0.05)。结论CAFs来源外泌体miR-20a通过直接作用CX43基因,下调PC-3细胞CX43的表达,从而显著降低细胞间通讯连接功能,增强前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。     

miR-152对前列腺癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

目的研究miR-152在前列腺癌、前列腺正常组织中的表达情况及其在前列腺癌细胞系中的作用。方法采用TaqMan荧光定量RT—PCR方法检测8例前列腺癌和8例前列腺正常组织的样本中miR-152的表达水平。运用Transwell细胞迁移实验及侵袭实验评估miR一152对前列腺细胞系PC-3和DU145细胞功能的影响。结果与正常前列腺组织相比,miR-152在前列腺癌组织中的表达水平显著下调（P〈0．05）。体外实验中上调miR152的表达可以显著降低前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力（P〈O．05）。结论miR-152在前列腺癌中可作为一种肿瘤抑制因子,影响前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。