人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

广州管圆线虫组织蛋白酶Z基因的原核表达及免疫学分析

目的克隆并原核表达广州管圆线虫组织蛋白酶-Z基因,评价其融合蛋白在免疫诊断中的应用前景。方法利用生物信息学分析工具,分析广州管圆线虫组织蛋白酶-Z的理化性质、结构与功能特征;克隆目的基因至原核表达载体pET30a(+),经PCR、双酶切鉴定后,IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,融合蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化;ELISA检测融合蛋白作为诊断抗原的敏感性及特异性。结果该蛋白理化性质较稳定,含有分泌型信号肽;含有构成半胱氨酸蛋白酶催化中心的Cys84、His232和Asn253三个氨基酸残基。成功构建了重组质粒且目的基因在E.coliBL21中获得高效表达,经亲和层析获得了纯化的融合蛋白。融合蛋白可被其免疫的BALB/c小鼠血清及感染广州管圆线虫的小鼠血清识别;作为包被抗原用于ELISA检测小鼠血清其敏感性及特异性均为100%与粗抗原无差别,检测其他寄生虫病人血清及正常人血清其特异性分别为100%和97.4%与粗抗原相比特异性较高。结论广州管圆线虫组织蛋白酶-Z与多个物种组织蛋白酶-Z基因同源,是一种半胱氨酸蛋白酶,含有信号肽,可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分,在广州管圆线虫病的免疫诊断方面有潜在的应用前景。     

JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

用无细胞蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白的研究

目的探索无细胞麦芽体外蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白可行性,并检测用重组蛋白制备的免疫血清对原虫蛋白的特异性反应。方法将目的蛋白PfRON2的部分片断克隆连接到重组表达载体后,用无细胞麦芽体外蛋白合成系统进行重组表达并纯化,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫斑点实验(Western blot)和免疫荧光抗体实验(IFA)检测该血清对恶性疟蛋白的特异性反应。结果成功克隆的重组质粒能在无细胞麦芽体外蛋白合成系统中生成大小相符的GST融合蛋白,并能较好地纯化。免疫斑点实验中,用该重组蛋白制备的免疫血清能检测到重组蛋白和恶性疟目标蛋白,免疫荧光抗体实验显示该免疫血清能成功地标记恶性疟目标蛋白所在部位。结论无细胞麦芽体外蛋白合成系统可应用于恶性疟原虫蛋白的重组表达,获得的免疫血清能特异性识别疟原虫蛋白。     

衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能.方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测.结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确.SDS-PAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右.结论 经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础.     

华支睾吸虫NOSIP基因的克隆表达及免疫学鉴定

目的对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)进行克隆和原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法从华支睾吸虫基因文库中获得CsNOSIP的全长cDNA并克隆至原核表达质粒pET-30a(+)中,诱导表达后用亲和层析柱进行纯化,用纯化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以获得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鉴定重组蛋白CsNOSIP的表达及其反应原性;采用ELISA检测rCsNOSIP免疫小鼠血清特异性抗体亚类水平。结果 CsNOSIP基因的开放阅读框(ORF)包含867 bp,编码288个氨基酸,PCR、双酶切及DNA测序表明pET-30a(+)-CsNOSIP重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,表达产物相对分子质量为35×10~3;经亲和层析法获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可被His单抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染华支睾吸虫小鼠血清及ESP免疫血清识别,重组蛋白免疫血清能识别CsESP;ELISA检测显示rCsNOSIP免疫小鼠血清特异抗体滴度为1∶25 600,以IgG1水平较高。结论 CsNOSIP可在原核表达系统中呈现高效可溶性表达,且具有抗原性,是华支睾吸虫分泌排泄抗原(CsESP)之一,免疫小鼠后可获得高滴度的特异性抗体,抗体亚类以IgG1为主,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

4种血清型登革病毒多表位重组抗原的表达及血清学初步评价

目的在原核表达系统中对登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白1(NS1)融合的B细胞抗原表位进行表达、纯化及血清学评价。方法将B细胞抗原表位用形成α螺旋的连接肽(EAAAK)2作为接头,串联合成1条全新的多表位融合重组基因rE,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白,用镍柱对重组蛋白纯化,并用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。以融合蛋白为抗原,用间接ELISA检测登革热病人血清IgM抗体。结果重组表达载体pET28a-rE构建成功,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,用镍柱纯化获得高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符,建立的间接ELISA具有较高的准确性。结论原核表达的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清学检测价值。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定北大核心CSCD

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

参与DNA修复的PIF1解链酶的纯化和ATP酶活性分析

目的 克隆并表达纯化人类PIF1蛋白,分析其生物化学活性.方法 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到PIF1解链酶基因,插入融合有组氨酸的表达载体pET24b,构建pET24b-PIF1重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察PIF1蛋白表达;通过快速液相蛋白色谱纯化(FPLC)系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化人类重组PIF1蛋白.薄层层析(TLC)法检测纯化PIF1蛋白的ATP酶活性.结果 克隆了人类PIF1基因,PIF1蛋白在大肠埃希菌(E.coli)中成功表达.结论 建立了PIF1蛋白纯化的方法,PIF1蛋白具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.