鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证

目的检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性。方法针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品。结果基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性。结论在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性。     

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的 探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD₅₀分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低。结论 不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降。     

鼠疫耶尔森菌LcrV抗原B细胞表位的预测

目的预测鼠疫耶尔森菌LcrV抗原的B细胞表位,为抗LcrV单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌蛋白B细胞表位组研究的可行方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析LcrV蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测和分析。结果LcrV蛋白的B细胞表位可能位于第16～24、26～31、45～50、175～181、208～213和280～289位等氨基酸区域内或附近,其中16～24、26～31、175～181、208～213等4个短肽都与文献报道相吻合。结论预测得到的表位为后续抗LcrV抗原单克隆抗体的制备奠定了理论基础,为进一步表位分析和鉴定提供了参考依据;预测结果的准确性高,有助于利用表位预测法建立鼠疫菌蛋白B细胞表位研究的平台。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的生物信息学分析及抗原表位预测北大核心CSCD

目的探讨鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的组成结构及生物学功能。方法运用ProtScale,TMHMM Server,Signal P 3.0 Server,NetPhos3.0 Server,SOPMA,Swiss-mode和DNAStar等生物信息学软件分析鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的氨基酸序列组成、理化性质、亲疏水性、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二、三级结构和B、T细胞抗原表位等。结果 CAF-1是由170个氨基酸构成的富含苏氨酸的稳定亲水蛋白,相对分子质量为17.7×10~3,理论等电点为4.83,不含跨膜区且磷酸化程度较高。二级结构中β转角和无规则卷曲为主要结构原件,分别占41.18%和32.35%。同源建模显示,GMQE和QMEAN评估分值分别为0.90和0.76。抗原表位预测显示,该蛋白含有多个B细胞优势抗原表位和7个优势CTL表位。结论生物信息学预测CAF-1基因编码蛋白为稳定分泌蛋白和外膜蛋白,含有较多的B、T细胞抗原表位,具有较好的抗原性,可作为新型疫苗的潜在候选基因。     

鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的生物信息学分析及抗原表位预测

目的探讨鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的组成结构及生物学功能。方法运用ProtScale,TMHMM Server,Signal P 3.0 Server,NetPhos3.0 Server,SOPMA,Swiss-mode和DNAStar等生物信息学软件分析鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的氨基酸序列组成、理化性质、亲疏水性、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二、三级结构和B、T细胞抗原表位等。结果 CAF-1是由170个氨基酸构成的富含苏氨酸的稳定亲水蛋白,相对分子质量为17.7×10~3,理论等电点为4.83,不含跨膜区且磷酸化程度较高。二级结构中β转角和无规则卷曲为主要结构原件,分别占41.18%和32.35%。同源建模显示,GMQE和QMEAN评估分值分别为0.90和0.76。抗原表位预测显示,该蛋白含有多个B细胞优势抗原表位和7个优势CTL表位。结论生物信息学预测CAF-1基因编码蛋白为稳定分泌蛋白和外膜蛋白,含有较多的B、T细胞抗原表位,具有较好的抗原性,可作为新型疫苗的潜在候选基因。     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

鼠疫耶尔森氏菌染色体上重要致病相关基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中表达鼠疫耶尔森氏菌染色体编码的重要致病相关基因。方法 运用生物信息学技术对鼠疫耶尔森氏菌基因组序列信息进行分析，选定了18个与病原菌粘附、侵袭宿主细胞相关的基因为克隆与表达的目的基因。通过PCR和TA克隆技术从鼠疫耶尔森氏菌基因组中克隆了这些目的基因。上述目的基因经双酶切回收后，分别导入原核表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Westernblot检测蛋白表达。结果 共获得14个可经IPTG诱导的高表达的重组转化子菌株。结论 上述重组转化子菌株表达的融合蛋白经进一步纯化可进行宿主感染鼠疫耶尔森氏菌后免疫应答的研究及抗体表达谱变化的研究。这些研究不仅对于鼠疫耶尔森氏菌致病机理的研究有意义，而且在鼠疫疫苗的研制上有重要价值。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原蛋白大肠杆菌分泌表达载体的构建

目的构建鼠疫耶尔森菌F1抗原蛋白的大肠杆菌分泌表达载体。方法 PCR法扩增鼠疫耶尔森菌的F1抗原基因,并插入大肠杆菌分泌表达载体p BAD/gⅢC中构建分泌表达载体。结果扩增出了长约500 bp的鼠疫耶尔森菌F1抗原基因并构建了该抗原的大肠杆菌分泌表达载体。结论本研究中我们用载体p BAD/gⅢC构建鼠疫耶尔森菌F1抗原的大肠杆菌分泌表达质粒,为后期制备针对鼠疫F1抗原的单克隆抗体或多克隆抗体,进一步建立便捷高效的鼠疫诊断方法奠定基础。     

四种耶尔森氏菌的抗原抗体相关性研究

目的了解鼠疫、假结核、小肠结肠炎和中间型耶尔森氏菌抗原抗体在免疫血清学中是否存在相关性?方法用四种耶尔森氏活菌分别或混合家兔耳静脉注射4次获得高效价抗血清,用鼠疫FI抗原和其他耶尔森氏菌全菌冻溶和耐热抗原,作鼠疫RIP试验和抑制试验。结果RIP仅能检出鼠疫菌单独或混合其他菌抗血清中的特异性FI抗体,FI抗原能完全抑制EV株、A2株和A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清中的特异性抗体,假结核、小肠结肠炎、中间型耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株抗血清抑制2~3管,对A2株混合不同耶尔森氏菌的抗血清不能抑制,假结核耐热抗原对EV株抗血清能抑制6~7管,对A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清抑制2管。结论FI抗原对三种耶尔森氏菌抗体没有相关性,其他3种耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株、A2株抗体有一定的相关性,而伪F2、519、520株耐热抗原对EV株抗体有较强亲缘相关性,对A2株抗体仅有一定的相关性。     

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的 从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法 使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果 生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论 空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。     

聚合酶链反应在一起疑似人间鼠疫诊断中的应用

目的对青海省海南州同德县河北乡赛羊村一起疑似人间鼠疫材料进行鼠疫耶尔森氏菌F1抗原检测。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术。结果在这起疑似人间鼠疫尸体的淋巴结、肝及脾等脏器中均检测到鼠疫耶尔森氏菌F1抗原。结论本法可用于疑似鼠疫材料的诊断，为疫情的准确判定提供可靠的科学依据。     

云南省金沙江中下游流域致病性耶尔森菌调查研究

目的 了解云南省金沙江中下游流域鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌3种致病性耶尔森菌的分布及流行现状。方法 选择云南省金沙江中下游流域5个县，采集鼠盲肠及犬肛门拭子标本，通过冷增菌后提取增菌液DNA并对foxA、ail、inv、caf1等特异基因进行PCR检测，基因阳性可疑标本进行菌株分离纯化后进行菌落PCR鉴定，对实验结果进行统计分析。结果 采集标本1 631份，其中鼠盲肠段标本985份、犬肛门拭子标本646份。自鼠肠道中共分离到小肠结肠炎耶尔森菌24株，分离率为2.44%(24/985),自犬肛门拭子中共分离到14株，分离率为2.17%(14/646),小肠结肠炎耶尔森菌总分离率为2.33%(38/1 631),且38株小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因检测均为阴性；自昭通永善县犬肛门拭子中分离到唯一1株假结核耶尔森菌，分离率为0.15%(1/646);未分离到鼠疫耶尔森菌。结论 云南省金沙江中下游流域鼠和家犬中携带非致病性小肠结肠炎耶尔森菌，云南省首次自鼠疫指示动物犬中分离到假结核耶尔森菌，未发现鼠疫耶尔森菌的相关线索。     

空肠弯曲菌AhpC蛋白B细胞抗原表位预测及抗原性分析

目的利用生物信息学预测分析空肠弯曲菌AhpC的跨膜结构、信号肽及B细胞抗原表位,并分析空肠弯曲菌AhpC优势B细胞抗原表位的抗原性,为后续疫苗研究提供依据。方法使用TMHMM Server V2.0、SignalP 4.1、IEDB等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌AhpC进行蛋白跨膜结构预测、信号肽及线性B细胞抗原表位进行预测分析。分别以原核表达的空肠弯曲菌AhpC蛋白和化学合成的表位肽为抗原,空肠弯曲菌AhpC抗体为一抗,通过ELISA及Dot blot对优势线性B细胞抗原表位的抗原性进行分析及筛选。结果生物信息学预测结果表明AhpC定位于空肠弯曲菌外膜,无跨膜结构,无信号肽,同时该蛋白中存在7个的B细胞线性表位。经Dot blot和ELISA检测发现其中AhpC4-16表位具有较强的抗原性,为优势表位。结论空肠弯曲菌AhpC保守存在于细菌表面,存在1个优势的B细胞线性抗原表位(AhpC4-16),可用于后续的疫苗开发研究。     

重组多肽酶联免疫吸附法检测抗Scl-70抗体的初步应用

目的制备人Scl-70抗原207～765位氨基酸片段融合蛋白作为自身抗原,探讨ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性和特异性。方法构建编码Scl-70抗原第207至第765位氨基酸片段的重组体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后,免疫印迹法鉴定抗原性,ELISA检测北京协和医院免疫科血清库中系统性硬化（SSc）及部分其他结缔组织病患者血清抗Scl-70抗体。结果重组融合蛋白在宿主菌中获得可溶性表达,免疫印迹法鉴定表明其能与标准抗Scl-70抗体阳性血清反应,而与正常血清、其他抗血清无反应。在36份SSc患者血清中,天然抗原免疫双扩散（DID）法共检出的6份阳性血清用重组多肽ELISA检测有5份呈阳性,30份经天然抗原DID法检测为阴性的血清用重组多肽ELISA检测有3份呈阳性;20份其他结缔组织病患者血清用重组多肽ELISA检测均为阴性。结论重组的207—765位氨基酸片段是Scl-70抗原的主要抗原表位区域,以重组多肽为基质ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性较高,为进一步研究抗体水平与临床病情变化的相关性奠定了基础。     

染色体编码的耶尔森氏菌毒力因子及其遗传学研究进展

进入80年代以来,由于重组DNA技术在耶尔森氏菌研究中的广泛应用,使得人们能够在分子水平对该菌属的毒力及致病因素进行深入探讨。继对各种质粒DNA及其表型特征的研究之后,细菌学家们已把目标投向主要遗传物质-染色体DNA的研究上,而且在许多方面已取得了重要突破,如对侵袭素、pH6抗原、肠毒素以及铁调节蛋白基因的克隆、分离、鉴定及序列分析等。本文就有关研究进展作一简述。 一、耶尔森氏菌的侵袭素 在许多感染性疾病中,微生物对上皮细胞的侵袭是致病过程的重要环节,耶尔森氏菌的这一作用也早已得到证明,但不同的病原体具有不同的侵袭机制。在三种致病性耶尔森氏菌中,鼠疫菌的感染方式和所致疾病与假结核菌和肠炎耶氏菌是截然不同的,提示它们在对上皮细胞的侵袭性方面具有不同的分子基础。当它们缺失共同的毒力质粒后,假结核菌和肠炎耶氏菌虽然失去致病性,但仍具有侵袭组织培养细胞和感染动物上皮细胞的能力,表明侵袭决定体是由染色体DNA控制的。     

鼠疫菌6MD质粒对假结核菌外膜蛋白的影响

检查了来自鼠疫耶尔森氏菌 Y·pestis 的6MD 质粒转入假结核耶尔森氏菌 Y·(?)berculosis 后,对后者表达的耶氏菌属外膜蛋白(Yops)的影响。研究表明,6MD 质粒所编码的 pla 基因产物可以降解这些外膜蛋白,同时,也能降解假结核菌的 YadA 蛋白,使它转变为几种分子量略小的蛋 质亚单位或片断。本文还讨论了这种现象对鼠疫菌和假结核菌毒力的影响。     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测