启膈散及其拆方抑制原代培养食管癌细胞PLC-γ1介导的信号转导的作用

目的观察启膈散及其活血和化痰两个拆方对原代培养的食管癌细胞磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)介导的细胞信号转导的影响,以探讨启膈散治疗食管癌的作用机制。方法从外科切除的原发性食管癌组织采集食管上皮细胞进行原代培养,加入启膈散及其活血和化痰两个拆方的水提物,测定细胞生长活性、PLC-γ1、EGFR、PDGFR、PKCα、磷酸化蛋白PY99和MARCKS(Ser152/156)表达水平、细胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]I)及PLC-γ1和PKC活性。结果启膈散及其拆方对原代培养的食管癌细胞生长、PLC-γ1、EGFR、PDGFR、PKCα、磷酸化蛋白PY99和磷酸化MARCKS(Ser152/156)表达、[Ca2 ]i及PLC-γ1和PKC活性有不同程度的抑制作用,以活血组作用最强。结论启膈散及其拆方通过不同程度的抑制食管癌细胞PLC-γ1介导的信号转导而抑制肿瘤细胞的生长。     

启膈散的研究

启膈散出自《医学心悟》一书,该方组方严谨,配伍得当,多用于治疗食管类疾病且疗效确切。近年来,围绕此方的研究不断深化,临床和药理研究都取得了新进展。根据搜集的文献可以看出,启膈散的临床研究多与治疗食管相关疾病为主,尤其是对于食管癌的治疗应用相对成熟。对其他疗效确切疾病的治疗也多是与“噎膈”症状或病机相近的疾病,这对启膈散在临床应用提供了新思路。启膈散的药理学研究多以食管癌为着手点,不断发现对疾病产生作用的多条信号通路,并以此阐明作用机制。启膈散的治疗作用不单局限于食管癌,但对于治疗有效其他疾病的药理学研究却少之又少,值得进一步探索。笔者将从临床研究、药理学研究两方面对启膈散的研究进展作简要概述。     

启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤对人食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的观察启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤、补气运脾汤各证方对人食管癌细胞株EC9706细胞增殖和凋亡的影响作用。方法体外培养人食管癌细胞株EC9706细胞,分别用启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤处理细胞,倒置显微镜下观察EC9706细胞增殖和形态变化;MTT法检测各证方对EC9706细胞增殖影响的量效关系;TUENL法和荧光显微镜观察各证方诱导EC9706细胞凋亡的作用;Annexin V FITC/PI双标记流式细胞术检测各证方诱导EC9706细胞凋亡率：结果启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤对EC9706细胞增殖的抑制率随药物浓度增加而上升,呈现剂量-效果依赖性关系,在药物浓度为6400μg/ml时,三组抑制率分别为78%、63%、78%。启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤不同程度地诱导细胞发生凋亡,各组诱导细胞的凋亡率依次为：沙参麦冬汤组〉启膈散组〉通幽汤组。结论启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤可不同程度地明显抑制人食管癌细胞株EC9706细胞增殖,补气运脾汤对体外培养细胞增殖的直接抑制作用很弱。启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤均可不同程度诱导人食管癌EC9706细胞凋亡。     

启膈散对食管癌EC9706细胞miR-133a/PI3K/Akt信号通路甲基化的影响

目的 观察启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌EC9706细胞micoRNA-133a(miR-133a)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路甲基化的干预作用。方法 流式细胞术检测启膈散对EC9706细胞的凋亡的影响；蛋白印迹免疫法(Westernblotting)分别检测采用Akt抑制剂、转染miR-133a模拟物及DNMT1抑制剂后启膈散对DNMT1蛋白表达的影响；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测启膈散对miR-133a及IGF-1R mRNA表达量的影响。结果 与空白对照组比较，启膈散组可增加EC9706晚期凋亡率及总凋亡率(P<0.05),与DNMT1抑制剂组相比，启膈散组、联合用药低剂量组晚期凋亡率差异显著(P<0.05)。与空白对照组比较，启膈散及各联合用药组均能够抑制食管癌EC9706细胞DNMT1蛋白的表达(P<0.05);启膈散与PI3K/AKT信号通路抑制剂联合用药组、启膈散与转染miR-133a模拟物联合用药组均对DNMT1蛋白的抑制呈现一定程度的的协同增效作用。与空白对照组相比，启膈散组、DNMT...     

启膈散提取物抗肿瘤活性的体内初步实验研究

目的:探讨中药启膈散的抗肿瘤作用和免疫学调节作用及其作用机制,为抗肿瘤新药开发、研制提供科学依据。方法:通过启膈散提取物饲喂荷瘤小鼠分析其在动物体内抗肿瘤作用及对小鼠免疫功能的影响。结果:启膈散提取物饲喂荷瘤小鼠后,小鼠进食、活动、体重等一般状况明显好于对照组,胸腺指数、脾指数优于对照组,抑瘤率分别达15.4%、13.3%、21.7%。且可促进小鼠脾细胞增殖,促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能,促进NK细胞杀伤功能。结论:启膈散不仅能够抑制肿瘤生长、还能增强免疫功能。     

中药启膈散诱导K562凋亡的实验研究

目的 :发掘研究中药古方 ,探讨启膈散抗肿瘤机理 ,扩大古方应用范围 ,为扩大启膈散临床应用提供实验依据。方法 :运用 MTT法观测启膈散对 K5 62细胞细胞毒活性、Gimusa染色法观测启膈散对 K5 62细胞形态学改变、ELISA法观察启膈散对 K5 62肿瘤细胞凋亡的影响。结果 :启膈散对瘤株表现出很强的细胞毒活性 ,且细胞毒活性有明显的量效关系 ;经启膈散作用 72小时后 ,部分细胞出现胞浆空泡、核固缩、核边集、核破碎、核小体形成等细胞调亡的特征 ;启膈散对 K5 62细胞凋亡存在时间依赖性。结论 :促进肿瘤细胞的凋亡是启膈散抗肿瘤机理之一     

启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤对人食管癌EC9706细胞Caspase-3介导的细胞凋亡信号转导的影响

目的:研究启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤对人食管癌EC9706细胞增殖影响,并从Caspase-3介导的细胞凋亡信号转导通路探讨三方作用机制。方法:体外培养食管鳞癌细胞株EC9706细胞,分别加入启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤提取液培养处理细胞,通过MTT染色观察细胞增殖变化,通过Western blot法检测Caspase-3介导的细胞凋亡信号转导通路蛋白表达。结果:启膈散、沙参麦冬汤和通幽汤的IC50值分别是1462、1232、2875μg/m L,均可促进Caspase-3蛋白表达而诱导细胞凋亡,而Cyt.C蛋白表达较弱;启膈散和沙参麦冬汤对FADD、Fas、TNFR1和DR5蛋白表达有不同程度地影响。结论:三方可通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡,其中启膈散主要通过非依赖FADD死亡受体途径,沙参麦冬汤主要通过依赖FADD死亡受体途径,通幽汤可能通过其他凋亡蛋白参与的上游信号途径而激活Caspase-3致细胞凋亡。     

启膈散临证举隅

启膈散，出自清代医家程钟龄所著之《医学心悟》一书。原方是为治疗“噎膈”所设。启膈散具有润燥降气，开郁化痰的作用，所针对的是噎膈轻症患者。该方的药物组成：沙参三钱，丹参三钱，茯苓一钱，川贝母一钱五分，郁金五分，砂仁壳四分，荷叶蒂两个，杵头糠五分，水煎服。笔者常运用其治疗一些内科疾病，疗效显著，举验案如下：     

中药启膈散研究进展

通过文献整理,对中药启膈散的研究进展进行总结归纳,观察中药启膈散的临床运用及实验研究,指出启膈散对内科疾病治疗的临床运用,以及和放化疗联合运用对肿瘤的增效减毒作用的临床运用及实验研究进展。     

启膈方对人食管癌细胞Eca109、TE13及Cx26表达的影响

目的探讨启膈方治疗食管癌的可能作用机制。方法采用人食管癌细胞Eca109及TE13,将各细胞分为对照组及启膈方高剂量组、启膈方低剂量组。采用MTT法观察启膈方对食管癌细胞增殖的影响,应用Transwell小室法检测启膈方对食管癌细胞迁移的影响,应用激光共聚焦显微镜及流式细胞术观察启膈方对食管癌细胞间隙连接蛋白26(Cx26)表达的影响,采用RT q-PCR法观察启膈方对食管癌细胞中Cx26水平的影响。结果启膈方正常剂量在体外环境不能抑制Eca109及TE13细胞增殖。启膈方高剂量组Eca109迁移细胞数明显少于对照组和启隔方低剂量组(P0.01),启膈方高、低剂量组TE13迁移细胞数明显少于对照组,且启膈方高剂量组明显少于启隔方低剂量组(P0.05或P0.01)。经启膈方作用后的食管癌细胞Eca109和TE13中Cx26蛋白及mRNA水平表达明显增高(P0.05)。结论启膈方可抑制人食管癌细胞Eca109、TE13的增殖与迁移,并能够增强Cx26在蛋白水平及转录水平的表达,使食管癌细胞间隙连接增强,从而抑制细胞的迁移。这可能是其治疗食管癌的部分作用机制。     

启膈散对食管癌细胞微丝骨架重排的影响

目的研究启膈散对食管癌细胞微丝骨架的影响,并探讨其抑制转移的机制。方法采用高分化人食管癌细胞TE1、Eca109及低分化人食管癌细胞TE13,将细胞分为对照组(未加药)及启膈散(100μg/mL)组。应用免疫荧光法观察各组食管癌细胞形态的变化,激光共聚焦显微镜观察启膈散对食管癌细胞微丝排列的影响。采用细胞阻抗检测技术检测启膈散对食管癌细胞同基质黏附力及细胞迁移能力的影响。结果启膈散组食管癌细胞TE1、TE13及Eca109中微丝排列更规则,伪足消失,对照组细胞中微丝排列混乱,且以细胞膜微丝排列不规则更为明显,在细胞膜上微丝排列缺乏同向性,向外伸出伪足。与对照组比较,启膈散组食管癌细胞TE1和TE13中形态规则的细胞数目明显增多(P0.05),TE1与TE13细胞经启膈散作用后细胞与基质的黏附力及迁移能力均明显降低(P0.05,P0.01)。结论启膈散能够抑制食管癌细胞发生微丝骨架重排,使食管癌细胞同基质之间的黏附力降低,从而抑制细胞的迁移。     

加减三甲散及其拆方对肝纤维化大鼠血清LN、Ⅳ-C的影响

目的:通过观察加减三甲散及其拆方对肝纤维化大鼠血清LN、Ⅳ-C含量的影响,阐明本方及拆方治疗肝纤维化的机理。方法:四氯化碳制造大鼠肝纤维化模型,造模同时灌胃加减三甲散及拆方浸膏,并设单纯模型组、秋水仙碱组做对照,观察各组大鼠血清LN、Ⅳ-C含量。结果:治疗组均有效,以全方组效果最好。结论:加减三甲散及其拆方能够促进胶原降解,对实验性肝纤维化有明显治疗作用,全方优于拆方。     

噎膈证方对人表皮生长因子刺激的食管癌EC9706细胞生长信号转导的影响

目的:研究噎膈病辨证施方在不同浓度下对食管癌细胞生长的影响;从生长信号转导角度探讨启膈散等对人表皮生长因子(hEGF)刺激的食管癌EC9706细胞生长抑制机理。方法:体外培养人表皮生长因子(hEGF)刺激的EC9706食管鳞癌细胞株,分别加入启膈散等4方提取液,通过MTT染色、流式细胞技术等观察细胞增殖变化;以western blot法检测PLC-γ1介导的生长信号通路蛋白表达。结果:启膈散(Q)、沙参麦冬汤(S)、通幽汤(T)IC50值分别为849,1004,1 615μg.mL-1;可抑制PLC-γ1信号通路相关蛋白表达,抑制作用强度:TQS;结论:除补气运脾汤外,噎膈证方可抑制hEGF刺激的EC9706细胞的生长;启膈散等3方可通过抑制PLC-γ1介导的生长信号转导而抑制EC9706细胞生长。     

启膈散对小鼠单核巨噬细胞功能的影响

目的探讨启膈散治疗食管癌作用机制。方法 100只小鼠随机分为10组,启膈散1、2、3、4、5、6、7组各10只,刀豆素A（ConA）组10只,脂多糖（LPS）组10只,磷酸缓冲液（PBS）组10只。四甲基偶氮唑盐（MTT）法、L929细胞毒生物法检测各组小鼠单核巨噬细胞代谢、吞噬功能及分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的功能。结果启膈散各组在促进小鼠单核巨噬细胞增殖、增强单核巨噬细胞吞噬功能及分泌TNF-α的功能方面与ConA组、LPS组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,启膈散组优于ConA组和LPS组,且存在明显量效关系。结论启膈散可通过促进小鼠单核巨噬细胞增殖、增强单核巨噬细胞吞噬功能及分泌TNF-α的功能从而达到抑制肿瘤生长的作用。     

启膈散对人食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及miR-133a/Akt/mTOR信号通路的影响

目的 观察启膈散对EC9706细胞增殖、凋亡的影响和对微RNA-133a（miR-133a）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的影响。方法 采用乙酸乙酯法提取启膈散有效部位；噻唑蓝（MTT）比色法筛选启膈散细胞用药剂量及检测启膈散对EC9706细胞增殖的影响；流式细胞仪检测启膈散对EC9706细胞凋亡的影响；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测启膈散对miR-133a及胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）mRNA表达的影响；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测启膈散对miR-133a/Akt/mTOR通路靶蛋白Akt，mTOR的表达。结果 与空白组比较，启膈散可抑制EC9706细胞的增殖（P<0.01），并呈剂量依赖性，筛选30%抑制浓度（IC₃₀）40 mg·L^-1和半抑制浓度（IC₅₀）80 mg·L^-1进行后续实验；与空白组比较，抑制剂组、抑制剂+启膈散组均可抑制EC9706细胞增殖（P<0.01），筛选抑制剂0.25 μmol·L^-1进行后续实验；与空白组比较，启膈散80 mg·L^-1组可明显促进EC9706细胞晚期凋亡率及总凋亡率（P<0.05），启膈散40 mg·L^-1组可促进EC9706细胞晚期凋亡率（P<0.05），与Akt/mTOR抑制剂联合用药后，可协同增效。与空白组比较，各组均能提高miR-133a表达（P<0.05），其中抑制剂与中药抑制剂+启膈散组促进作用明显。与空白组比较，各组均能够均可明显降低Akt，mTOR蛋白表达（P<0.05），与单独用药比较，抑制剂与中药联合应用组Akt，mTOR的蛋白表达有所降低。结论 启膈散能够抑制食管癌EC9706细胞的生长，促进EC9706细胞的凋亡，其抑制机制可能与调控miR-133a的表达，影响其下游Akt/mTOR信号通路有关。     

基于网络药理学探讨启膈散治疗食管癌的作用机制

目的:基于网络药理学方法探讨启膈散治疗食管癌的可能作用机制。方法:在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及中药成分数据库(TCMID)筛选并收集启膈散的活性成分及其对应靶标。利用Uniprot数据库获取药物活性成分对应靶标的基因,并与通过人类基因组注释数据库(GeneCards)所获得的人食管癌相关基因做对比,获得启膈散与食管癌重合的潜在作用靶标基因。使用Cytoscape3.6.1软件绘制启膈散的"活性成分-作用靶标"网络图。通过String数据库获取潜在作用靶标之间的互作关系,并导入Cytoscape3.6.1软件构建靶蛋白互相作用网络图。利用DAVID数据库对启膈散治疗食管癌的潜在作用靶标进行Go分类富集分析和KEGG通路富集分析,并运行R语言得到其高级气泡图。结果:从启膈散中共得到88个候选活性成分,包括槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、丹参酮ⅡA(tanshinone iia)、柚皮素(naringenin)等,142个潜在作用靶标,包括RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤抑制因子(TP53)、白细胞介素-6(IL-6)、重组人半胱天冬酶-3(CASP3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等,主要通路有蛋白酪氨酸激酶/信号转导转录激活因子(Jak-STAT)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子(NF-kappa B)、肿瘤抑制基因p53等信号通路。结论:启膈散治疗食管癌的作用机制可能与AKT1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA等靶标以及调节Jak-STAT、PI3K-Akt、MAPK、NF-kappa B、p53等信号通路有关。     

刀豆壳、胡桃膈治呃逆

刀豆壳、胡桃膈治呃逆上海市中医医院（２０００９０）杨文瑞呃逆，是指患者呃呃连声，不能自制，乃膈肌痉挛所致，中医临床辩证有虚实，寒热之分，但往往虚实错杂，寒热难分。笔者曾用“丁香柿蒂汤”，“启膈散”等方治疗，甚少显效，因而改用刀豆壳３０ｇ，胡桃膈９ｇ，...     

启膈方对小鼠免疫功能的影响

目的：发掘研究古方，探讨启膈Ⅰ号方和启膈Ⅱ号方免疫调节机理，为扩大临床应用围范提供实验依据。方法：本实验运用MTT法、硝酸银染色法、生物法等观察启膈Ⅰ号方和启膈Ⅱ号方对小鼠免疫功能的影响，及逆转BGC823肿瘤细胞培养上清对小鼠兔疫抑制作用。结果：启膈Ⅰ号方、启膈Ⅱ号方能促进小鼠单核细胞TNF的分泌、促进小鼠T淋巴细胞的增殖、促进小鼠B淋巴细胞IgG的分泌，逆转BGC823肿瘤细胞培养上清对小鼠脾细胞增殖的抑制作用。结论：启膈Ⅰ号方和启膈Ⅱ号方能调节免疫功能和逆转肿瘤对免疫功能的抑制作用。     

建立启膈方UPLC指纹图谱并验证启膈方对食管癌转移的影响

目的：观察启膈方对食管癌细胞迁移及侵袭的抑制作用,并建立启膈方的超高效液相(ultra performance liquid chromatography, UPLC)指纹图谱。方法：制备启膈方冻干粉,将高分化食管癌细胞Eca109分成对照组和启膈方组,应用划痕实验检测经启膈方干预前后食管癌细胞迁移能力的改变,借助荧光显微镜观察启膈方干预前后细胞形态的变化,采用蛋白芯片观察启膈方干预后肿瘤相关生长因子的变化,采用ACQUITY CSH C18(2.1mm×100 mm, 1.7μm)色谱柱,梯度洗脱、流速0.4 mL/min、检测波长254 nm、柱温40℃,并建立启膈方冻干粉UPLC指纹图谱。结果：启膈方组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.05),荧光显微镜观察显示经启膈方干预后细胞形态规则,蛋白芯片结果显示启膈方能够降低肿瘤相关生长因子的表达,10批启隔方冻干粉相似度均在0.9以上,共标定了17个共有峰,指认出7个色谱峰,分别为迷迭香酸、异槲皮苷、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸E、金丝桃苷、紫草酸。结论：启膈方能够降低肿瘤相关生长因子的蛋白表达,从而降低食管癌细胞迁移能力,建立...     

启膈I、Ⅱ号方抗肿瘤机制的体外实验研究

目的 探讨启膈I、Ⅱ号方抗肿瘤的机制。方法 运用MTT法观察启膈I、Ⅱ号方对肿瘤细胞的抑制作用及对DALB／C小鼠脾细胞增殖的影响。结果 启膈I号方、Ⅱ号方能抑制人白血病细胞株K562、人胃癌细胞株BGC 823、人食管癌细胞株TEl3的增殖，并能促进BALB／C小鼠脾细胞的增殖。结论 启膈I、Ⅱ号方对肿瘤有明显抑制作用，又能增强免疫功能。