基因重组卡介苗的研究现状

卡介苗已成为可同时表达多种外源抗原的新型疫苗载体 ,通过基因工程技术构建重组卡介苗是改造和提高传统卡介苗的有效途径。本文就重组卡介苗的重要作用、分泌细胞因子的重组卡介苗在免疫应答中的作用特点及应用现状 ,重组卡介苗的培养与生产条件、存在的问题及应用前景进行简要概述。     

四种卡介苗重组疫苗对小鼠免疫原性的研究

目的研究esat6-卡介苗重组疫苗、mpt64-卡介苗重组疫苗、ag85a-卡介苗重组疫苗、ag85b-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法通过ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。结果以生理盐水、卡介苗为对照,用各卡介苗重组疫苗免疫小鼠后,各组小鼠体重变化与对照组相比差异无统计学意义。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清,各组有其特异性抗体产生;ag85a-卡介苗重组疫苗能提高卡介苗刺激B细胞产生抗体的水平;各卡介苗重组疫苗免疫后15d,抗体水平已有升高,45d时达到最高水平。用不同抗原刺激各组小鼠脾淋巴细胞,平均刺激指数均达2.0以上,esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数稍高,其它各组之间差异无统计学意义。结论结核分枝杆菌esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因在卡介苗中都能够表达特异的蛋白,刺激小鼠产生特异性抗体,均能刺激T淋巴细胞产生细胞免疫。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定

目的ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.最后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果电转化后的卡介苗能在含10mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

重组寄生虫-BCG疫苗研究进展

卡介苗（BCG）由于其广泛应用的安全性及其免疫佐剂作用，以其为载体的重组疫苗研究日益被科学家们重视。本文简要概述了近年来硕大利什曼原虫、疟原虫、弓行虫、肝片吸虫等寄生虫重组BCG疫苗的构建及免疫机制的研究进展。     

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化E.coli BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究

通过SOE法（重叠延伸，Gene splicing by overlap extension），扩增cfp10-esat6融合基因，与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原（α-Ag）信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗，热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG，为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。     

重组结核病疫苗rBCG-IL-12p70-TB10.4的免疫效应

目的将成功构建的重组卡介苗rBCG-IL-12p70-TB10.4免疫BALB/c小鼠,研究其免疫效应,为结核病新疫苗的研发提供依据。方法将融合基因IL-12p70-TB10.4克隆入pMV361构建重组质粒,以电转化方式将重组质粒导入卡介苗基因组,构建重组结核病疫苗rBCG-12p70-TB10.4(rBCG-IT)。将此重组卡介苗免疫BALB/c小鼠,分别于免疫后3、6、9和12周,用间接ELISA检测特异性抗体滴度水平,XTT检测脾细胞增值反应,流式细胞仪检测脾CD4+T、CD8+T细胞亚型的比例,ELISA试剂盒检测细胞因子的诱生。结果在免疫后3~12周,rBCG-IT组脾细胞增殖反应均明显强于其他各组(P0.01),该组IFN-γ诱生量及CD4+T细胞比例均显著高于rBCG-I组、rBCG-T组及BCG组(P0.01)。IgG2a/IgG1比值在免疫后各时间点的变化趋势提示rBCG-IT可诱导Th1型细胞免疫应答。结论重组疫苗rBCG-IT可诱导产生较BCG更强、持续时间更长的特异性细胞免疫应答,可对其免疫保护作用进行深入研究。     

可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究

目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。     

干扰素,卡介苗增强肝癌大鼠单核吞噬细胞抑制肝癌细胞增殖作用？…

目的；比较肝癌大鼠在体应用干扰素，卡介苗或二者联用后，几种单核巨噬细胞体外抗肝癌细胞作用的变化。方法：以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌，实验组同时给予干扰素，卡介苗或二者联用，于第８，１２，１６周分离肝枯否细胞，腹腔巨噬细胞，肺巨噬细胞，脾巨噬细胞和血单核细胞，分别与人肝癌细胞联合培养，用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定５种细胞抑肝癌细胞增殖作用，结果：实验组肝理变化明显轻于对照组，以干扰素与卡介苗联用组病变最     

重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位的鉴定

目的 鉴定重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位。方法 用抗原提呈试验、T细胞增殖试验、ELISPOT试验和表位作图测试重组MalE蛋白的T细胞表位。结果 重组BCG.MalE功能性表达了MalE蛋白的4种H-2^d限制性T细胞表位。结论 在4种表位中，p68-82是重组MalE蛋白的主要T细胞表位，而其余3个为次要表位。     

卡介苗素膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的临床研究

目的探讨卡介苗素膀胱内灌注预防膀胱癌术后复发的疗效、安全性．方法47例膀胱癌术后患者分2组。分别应用卡介苗素和卡介苗定期行膀胱内灌注，随访10～32个月，了解灌注后肿瘤复发情况及并发症。并于灌注前、后检测2组尿液中IL－2、IL－6、IL－8的变化情况．结果卡介苗膀胱灌注组肿瘤复发4例（17．4％）。副反应发生18例（78．3％），卡介苗素膀胱灌注组肿瘤复发5例（20．8％）。副反应发生率11例（45．8％），2组尿液中IL－2、IL－6、IL－8值灌注后高于灌注前（P〈0．05）．两组肿瘤复发率、IL-2、IL-6、IL-8值灌注前后比较无显著差异，副反应卡介苗组明显高于卡介苗素组（P〈0．05）．结论卡介苗素膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的有效率与卡介苗相同，但不良反应明显减少。患者耐受性好，因此卡介苗素可成为膀胱浅表移行上皮细胞癌临床治疗和预防复发的一种有效药物．     

卡介苗菌体多糖对试验动物免疫调节的初步观察

卡介苗(BCG)为一种非特异性的免疫调节剂,目前人们已用BCG作为免疫调节剂治疗肿瘤及感染等疾病,并证明确有疗效。但是由于直接应用BCG治疗副反应较重,影响其临床应用,因此我们对卡介苗菌体多糖(B-PS)进行了提纯,并对其调节机体免疫作用进行了初步观察。     

斯奇康在临床上的应用

临床上许多疾病的发生都可能与免疫功能失调有关，斯奇康（卡介苗多糖核酸）作为一种新型生物免疫调节剂，因其具有广泛的免疫调节作用，故被广泛应用于皮肤、内、儿、五官、传染及肿瘤科等领域，实践证明其应用在上述领域近期疗效确切，安全性好。斯奇康的作用机理：①免疫调节作用：调节机体内的细胞免疫、体液免疫，激活单核吞噬细胞功能，增强机体抗病能力；     

CXCL16抗体可阻断BCG和LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤

目的研究CXCL16抗体体内阻断对小鼠免疫性肝损伤的影响。方法克隆、表达和纯化小鼠趋化因子CXCL16活性蛋白，免疫动物制备特异性抗体。抗体体内注射免疫性肝损伤模型小鼠，观察CXCL16抗体对肝脏损伤、ALT水平及小鼠生存率的影响。结果获得了高纯度的活性CXCL16重组蛋白及其特异性抗体，特异性抗体阻断明显改善肝脏的病理损伤，降低血清中ALT水平、延长模型组小鼠的存活时间。结论获得了具有趋化活性的CXCL16蛋白和特异性抗体，CXCL16抗体对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠肝损伤具有显著保护作用。     

干扰素、卡介苗增强肝癌大鼠单核吞噬细胞抑制肝癌细胞增殖作用的研究

目的:比较肝癌大鼠在体应用干扰素、卡介苗或二者联用后.几种单核巨噬细胞体外抗肝癌细胞作用的变化.方法:以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌,实验组同时给予干扰素、卡介苗或二者联用.于第8、12、16周分离肝枯否细胞、腹腔巨噬细胞、肺巨噬细胞、脾巨噬细胞和血单核细胞,分别与人肝癌细胞联合培养.用H-TdR掺入法测定5种细胞抑肝癌细胞增殖作用.结果:实验组肝病理变化明显轻于对照组.以干扰素与卡介苗联用组病变最轻.实验组5种细胞体外抗肝癌细胞作用明显增强,卡介苗的作用强于干扰素.尤以两者联用组效果最佳,使效应细胞作用增强1～5倍.结论:研究为肝癌治疗合理选用免疫制剂提供了实验依据.     

重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法：将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB／c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗（BCG）、INH＋PZA和重组BCG联合INH＋PZA治疗，于第一次治疗后3个月，处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-7．肺、脾组织中GLS表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果：重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量（10gCFU／g）比重组BCG和INH＋PZA治疗组显著降低；重组BCG和INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组BCG联合INH＋PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。重组BCG和INH＋PZA组病变轻且局限，生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛。重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺组织病变最轻。结论：GLS／IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用；重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。     

结核分支杆菌重组BCG疫苗研究进展

结核分支杆菌引起的结核病是一种人兽共患的慢性传染病，短程督导化疗是治疗该病的主要措施，卡介苗是预防该病的唯一疫苗，但其免疫效果极不稳定。章介绍了7种结核分支杆菌重组BCG疫苗构建及其免疫机制等方面的研究进展。     

钩端螺旋体外膜抗原基因ompL1在卡介苗中的克隆和初步 …

目的 将钩端螺旋体外膜基因ｏｍｐＬ１克隆到大肠杆菌－卡介苗（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ）穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，将重组质粒导入ＢＣＧ并对重组ＢＣＧ的表达进行初步表达研究。方法 采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（钩体）赖型０１７株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ｏｍｐＬ１，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入ＢＣＧ。斑点杂交筛选重组ＢＣＧ，再通过免疫印迹对其表达     

卡是苗在哮喘治疗中应用的免疫学基础

本篇综述讨论了哮喘的免疫学发病机制和减毒卡介苗的免疫调节机制，从免疫学角度阐述了它们的相互关系。并提出减毒卡介苗作为免疫调节在剂哮喘防治中应用的可能性以及存在的问题。     

北京株卡介苗诱导小鼠脾脏抑制细胞的观察

北京株卡介苗是我国目前所应用的几种卡介苗菌株之一。尽管对它的免疫作用已进行过一些研究,但它是否具有诱导活化抑制细胞的功能,至今尚未见报导。本文采用~3H—TdR 掺入法测定淋巴细胞增生率的检测系统,首先观察了经尾静脉注射过北京株卡介苗后的 Swiss 小鼠(实验鼠),其脾细胞本身在体外对 PHA 和 ConA 的应答反应跟同系对照鼠