人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因在体内和体外的表达

构建人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７湖北株（ＨＢ）基因真核表达质粒,探讨其在哺乳动物体外,体内表达状况,为本地区ＨＰＶ相关肿瘤的基因治疗提供依据。方法采用分子克隆技术,构建ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ重组表达质粒,磷酸钙－ＤＮＡ沉淀技术及基因免疫技术将外源目的基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞及大、小鼠体内ＰＣＲ,ＲＴ－ＰＣＲ,免疫荧光染色技术对外源目的基因及其产物（ｍＲ－ＮＡ,蛋白质。     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆、表达及其抗原性研究

目的：克隆、表达ＨＰＶ１６湖北株Ｅ７基因并探讨Ｅ７蛋白的免疫学性质。方法：应用基因克隆技术克隆、表达ＨＰＶ１６Ｅ７基因,纯化Ｅ７蛋白并免疫动物,用ＥＬＩＳＡ检测动物血清中的特异性Ｅ７抗体,进而评估Ｅ７蛋白的抗原性。结果：融合型的Ｅ７蛋白产量可达细胞总蛋白量的３０％;ＥＬＩＳＡ检测表明动物体内产生了特异性Ｅ７抗体。结论：ＨＰＶ１６湖北株Ｅ７蛋白可通过基因克隆方法制备,并保留了标准Ｅ７蛋白的抗原性。     

两种载体表达人乳头瘤病毒6型L_1基因的比较

以表达融合蛋白的载体PUR288以及高效表达载体PBV221作载体,在大肠杆菌内成功地表达了我国克隆的HPV6BVL_I基因,并对表达蛋白进行免疫学鉴定,对两种载体的表达情况进行了讨论。     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制

目的　研制特异性识别人促红细胞生成素的单克隆抗体 ,并对其生物学特性作出初步鉴定。方法　采用重组人促红细胞生成素 (rhEPO)为抗原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,经细胞融合、ELISA筛选、有限稀释亚克隆获得抗人EPO杂交瘤 ,以免疫印迹和快速Ig亚型分类对所获单抗作出初步鉴定。结果　经筛选获得 1株稳定分泌的抗rhEPO单抗的杂交瘤细胞株 (1D1)。亚型鉴定为IgG2b ,轻链为κ链 ,用Westernblot分析证实该单抗对rhEPO特异性识别。结论　成功获得 1株可分泌特异性识别rhEPO的单克隆抗体的杂交瘤     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

转铁蛋白受体基因表达及其抗体诊断肝癌的研究

目的：研究肝癌转铁蛋白受体（ＴｆＲ）的基因表达及其单克隆抗体免疫诊断肝癌的价值。方法对２０例肝癌手术标本包括癌巢组织、癌旁组织及周围正常组织进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,了解三种组织ＴｆＲ ｍＲＮＡ表达情况;通过间接免疫荧光及免疫组织化学ＡＢＣ法了解肝癌细胞和正常肝细胞膜上ＴｆＲ的表达情况。结果ＴｆＲｍＲＮＡ表达癌组织最高,癌旁组织次之,周围正常组织最低,后两者间无显著差异,肝癌细胞膜转铁蛋     

转铁蛋白受体基因表达及其抗体诊断肝癌的研究

目的　研究肝癌转铁蛋白受体(TfR)的基因表达及其单克隆抗体免疫诊断肝癌的价值。方法　对20例肝癌手术标本包括癌巢组织、癌旁组织及周围正常组织进行Northern blot分析,了解三种组织TfR mRNA表达情况;通过间接免疫荧光及免疫组织化学ABC法了解肝癌细胞和正常肝细胞膜上TfR表达情况。结果　 TfR mRNA表达癌组织最高,癌旁组织次之,周围正常组织最低,后两者间无显著差异;肝癌细胞膜转铁蛋白受体荧光阳性率明显高于正常肝细胞,两者有显著差异。免疫组织化学ABC法中19例强阳性染色,1例阴性。结论　转铁蛋白受体的基因表达在肝癌组织中明显增高,其单克隆抗体有希望成为肝癌免疫诊断的理想载体。     

抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术，用重组人Ｇ－ＣＳＦ（ｒｈＧ－ＣＳＦ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，然后将其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１融合，成功地获得了多种能够分泌抗ｒｈＧ－ＣＳＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交癌细胞。对其中的２株杂交瘤细胞２Ａ６和２Ｃ２分泌ＭｃＡｂ的研究表明，它们能够特异性地和ｒｈＧ－ＣＳＦ结合，而与重组的人ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－２α和ＴＮＦ细胞因子无交叉反应，为抗Ｇ－ＣＳＦ特异性ＭｃＡｂ。这些杂交瘤细胞经反复冻存和复苏后，仍能稳定地分泌ＭｃＡｂ。     

抗辣根过氧化物酶单克隆抗体的研制和鉴定

用国产辣根过氧化物酶(HRP)免疫BALB/C鼠,取免疫脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了7株分泌HRP特异性抗体的杂交瘤细胞株,其培养上清液的效价为256～4096,腹水效价为1024×10~3～4 096×10~3.上述7株细胞株中的6株所产生的单克隆抗体均能制备出质量良好的鼠单克隆PAP复合物,用于免疫组织化学及血清学研究均取得较理想效果。将7株分泌HRP特异性抗体的杂交瘤细胞株适应于含8-氮杂鸟嘌呤培养基中,诱导出了对HAT敏感的突变细胞株,为研制双特异性单克隆抗体奠定了基础。     

应用荧光定量聚合酶链方法检测宫颈组织中人乳头瘤病毒16E6基因

目的　建立荧光定量聚合酶链 (FQ PCR)方法检测宫颈细胞中人乳头瘤病毒 16型(HPV16 )E6基因的方法。方法　以 2 2 0例新疆妇女宫颈不同病变组织DNA作为样本 ,人乳头瘤病毒 16型 (新疆株 )E6基因 (HPV16E6 ,AF32 785 1)作为扩增的靶基因 ,同时以人 β 肌动蛋白基因片段作为内参照 ,借助于设计的目的基因引物 ,两个特异的荧光探针 ,在筛选的FQ PCR优化反应体系中 ,同时对两个基因片段进行扩增 ,得到HPV16E6的相对含量。结果　对 β 肌动蛋白阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计分析 ,新疆妇女宫颈脱落细胞标本 96例中 ,HPV16E6阳性 3例 (3 3% ) ;宫颈癌蜡块组织 5 9例中HPV16E6阳性 4 9例 (83 0 % ) ;宫颈上皮内瘤变 (CIN)蜡块组织 6 5例中 ,HPV16E6阳性 2 8例 (75 7% ) ;宫颈炎蜡块组织 33例 ,HPV16E6阳性 2 8例 (93 3% )。HPV16E6的相对含量随病情加重呈上升趋势 ,二者呈显著正相关 ,相关系数为 0 83。结论　建立的FQ PCR检测宫颈不同病变组织内HPV16E6基因的方法 ,能反映单位细胞人乳头瘤病毒的复制情况 ,筛查宫颈癌患者 ,并可能应用于宫颈癌的风险评估和疗效观察。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

抗人白血病细胞单克隆抗体C_3H_6的产生及初步鉴定

本文报告了抗人白血病细胞单克隆抗体C_3H_6的产生.运用间接免疫荧光技术、ELISA、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术对其特征作了初步分析.结果表明:单抗C_3H_6与白血病细胞S_(7811)(免疫原)和K_(562)细胞有强阳性反应,与Raji 细胞和U_(937)细胞反应较弱.单抗C_3H_6主要与髓性白血病细胞有阳性反应.对鉴别AML 与ALL 有显著意义.并与AML-m_5的反应有非常显著意义,从而有助于鉴别AML-M_5与其他AML 的亚类(M_(1～4)).免疫印迹结果显示C_3H_6抗原为单一的肽链结构.其分子量为57kd.C_3H_6抗原很可能为一新的髓性白细胞分化抗原.