T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应

目的：研究T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c小鼠随机分为pcNSA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。每次免疫前及免疫开始后至第8周，取鼠血，应用间接免疫荧光检测小鼠抗体生成情况。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组、pcDNA3．1／TCRVβ＋IL－2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体，抗体滴度在第4周开始增高，第6周时达到高峰。在同一取血时间，pcDNA3．1／TCRβV8＋CpG＋脂质体组和pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组小鼠抗体滴度均高于pcDNA3．1／TCRβ8组（P＜0．001。结论：DNA重组质粒pcDN3．1/TCRVβ8可诱导小鼠产生特异性抗体淋巴瘤细胞的独特型抗体；IL－2、CpG和脂质体增强了TCRVβ8基因疫苗诱导的体液免疫反应。     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因及蛋白表达

目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达.方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.接种疫苗后5 d,用RT-PCR法检测重组质粒mRNA表达.接种疫苗后7 d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达,而pcDNA3.1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达.结论:T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物.     

TCR Vβ8+IL-2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒的构建

目的：构建TCRVβ8＋IL－2／pcDNA3．1亚克隆重组质粒。方法：先将TCRVβ8克隆入克隆载体pUC19，分别酶切IL－2pUC19和TCRVβ／pUC19，将IL－2连接到TCRVβ8／pUC19重组质粒上，然后将TCRVβ8＋IL－2基因从TCRVβ8＋IL－2／pUC19重组质上酶切下，克隆入pcDNA3．1表达载体上。结果和结论：经测序正实成功地构建了TCRVβ8＋IL－2/pcDNA3．1亚克隆重组质粒。     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

IL-2与TCRγ独特型DNA疫苗联合诱导小鼠特异性免疫反应

目的:观察白细胞介素 2 (IL- 2)与TCRγ独特型DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗肿瘤独特型免疫反应。方法: 24只 6~8周的健康纯系雄性BALB/c小鼠随机均分为 3组,在小鼠双侧股四头肌肌内注射 2. 5g/L盐酸布比卡因,每侧 50μl, 1次 /d, 5d后分组免疫。各小鼠分别于第 1周、2周、4周各免疫 1次,共 3次。①A组: 每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 100μg; ②B组:每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 TCRγ100μg;②C组:每次于股四头肌肌内注射pcDNA3. 1 -TCRγ100μg及IL 2 5μg。于末次免疫接种后第 5d将每组小鼠随机选 2只处死,分离出胫前肌,RT PCR法检测重组质粒在小鼠骨骼肌中的mRNA表达;间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况。结果:在pcDNA3. 1 TCRγ组及pcDNA3. 1- TCRγ+IL- 2组小鼠中用RT PCR法均检测到了重组质粒在肌肉中的mRNA表达。pcDNA3. 1- TCRγ组及pcDNA3. 1 -TCRγ+IL 2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体。在第 6周时,pcDNA3. 1 -TCRγ组小鼠抗体滴度最高达 1160;pcDNA3. 1 TCRγ+IL 2组小鼠抗体的滴度最高达 1640, 2组差异有统计学意义 (P< 0. 01 )。结论:TCRγ表达载体pcDNA3. 1 -TCRγ可以诱导小鼠产生特异性抗淋巴瘤细胞独特型抗体;应用IL -2免疫佐剂可使TCRγ独特型DNA疫苗     

pcDNA3/TCRγV1真核表达载体的构建及表达

目的：构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其存小鼠骨骼肌中的表达。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析。大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT—PCR法检测小鼠肌肉巾TCRγV1 mRNA的表达。结果与结论：pcDNA3／TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达。     

抗肿瘤血管生成VEGFR2 DNA疫苗的构建

目的 构建一种新的抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4）．方法 采用RT-PCR技术，从BALB／c胎鼠组织中扩增出鼠血管内皮生长因子受体flk-1胞外区1-4个袢的cDNA片段，并将其插入真核表达载体质粒pcDNA3．1＋中，构建成重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），经DNA序列分析证实后，将重组质粒经脂质体法转染真核表达系统COS-7细胞，通过Western blot实验检测重组质粒在真核表达系统COS一7细胞中蛋白的表达．结果 RT-PCR扩增产物为1248bp大小的基因片段，经过DNA序列分析证明与GeneBank所公布的flk-1胞外区1-4结构域碱基一致，成功构建了重组质粒pcDNA3．1＋／ilk-1（nl-4），并且该重组质粒在真核表达系统COS-7细胞中成功得到表达．结论 成功地制备了抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），为进一步开展有关抗肿瘤血管生成的动物实验和临床应用奠定了基础。     

过表达 TRPM8对膀胱癌 T24细胞增殖和侵袭的影响

目的：观察过表达TRPM8基因的质粒pcDNA3．1－TRPM8对人膀胱癌 T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将连有 TRPM8的质粒 pcDNA3．1－TRPM8稳定转染 T24细胞后筛选出阳性克隆。根据转染的质粒不同分为3组： T24组（未转染）、T24－0组[转染 pcDNA3．1（＋）质粒]和 T24－TRPM8组（转染 pcDNA3．1－TRPM8质粒）。应用 RT －PCR 检测 TRPM8 mRNA 改变,MTT 法检测 T24细胞的增殖情况,Transwell 检测细胞侵袭转移能力。结果T24－TRPM8组 TRPM8的 mRNA 水平表达较其他两组升高（P ＜0．05）,MTT 和 Transwell 分别显示 T24－TRPM8组 T24细胞增殖和转移率较其他两组增加（P ＜0．05）。结论过表达 TRPM8可以促进 T24细胞增殖及侵袭能力,从而促进膀胱癌的进展,是潜在的膀胱癌治疗靶点。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白高表达下调LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的将人乳头瘤病毒16型（HPV 16）E6蛋白真核表达载体pcDNA3．1（-）／E6转染巨噬细胞，观察E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响，为进一步研究HPV16E6蛋白的致病机制奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3．1（-）／E6通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24h后，用LPS刺激巨噬细胞，利用Western-blotting鉴定E6蛋白在巨噬细胞中的表达，ELISA检测pcDNA3．1（-）／E6转染的巨噬细胞不同时间（12、24及48h）培养上清液中TNF-α与IL-1β的含量，统计软件SPSS12．0分析所得数据。结果Western-blotting结果显示pcDNA3．1（-）／E6能在巨噬细胞中表达约18kD的目的蛋白，即E6蛋白；pcDNA3．1（-）／E6＋LPS纽培养上清中TNF-α与IL-1β的量明显低于巨噬细胞＋LPS组和pcDNA3.1（-）＋LPS组。pcDNA3．1（-）／E6＋LPS组与巨噬细胞＋LPS组和pcDNA3.1（-）＋LPS组比较，差异具有显著性（P〈0．01）。结论 HPV16E6蛋白瞬时高表达下调LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β。     

白细胞介素—10抑制人肾系统膜细胞脂酶A2及其前列腺素E2的合成

目的：观察白细胞介素－10（IL－10）对白细胞介素－1β（IL－1β）诱导的人系膜细胞HMC）胸质型磷脂酶A2（cPLA2）基因和蛋白表达及其前列腺素E2（PGE2）释放的影响。方法：利用体外培养的HMC，设立对照组、IL-10处理组、IL－1β处理组及IL－10＋IL－1β处理组；采用放免法检测培养上清中PGE2，应用逆转录－多聚酶链反应（RT－PCR）和蛋白质印迹（Western Blot)检测cPLA2mRNA和蛋白水平。结果：正常情况下，HMC低水平表达cPLA2mRNA和并蛋白并释放少量的PGE2；IL－1β能显著上调HMCPGE2释放及cPLA2mRNA和蛋白的表达（P值均＜0．01）；IL－10对基础状态下的HMCPGE2释放及cPLA2mRNA和蛋白表达无明显影响（P值均＞0．05），但可呈剂量依赖性地下调IL－1β诱导的PGE2释放及cPLA2mRNA和蛋白表达（P值均＜0．01）。结论：IL－10抑制诱导的HMCPGE2释放及cPLA2表达，提示IL－10对HMC具有多方面抗炎作用。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1，为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法 采用PCR从含有人源IL-2的质粒中扩增出IL-2片段，将人源IL-2插入真核表达载体pcDNA3．1／His—B中，构建的质粒命名为pcDNA3．1／His-昏IL-2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1基因片段，将回收的G1片段经双酶切插入到pcDNA3．1／His-B-IL-2，构建成新的质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1。采用脂质体介导包裹，转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达；采用原位杂交观察细胞内的基因表达，SDS-PAGE法作重组质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达-分子量为78kD左右的蛋白，对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1融合基因，融合基因能在真核细胞中瞬时表达。     

VEGF165和VEGF121在MC3T3-E1细胞中的表达及生物学功能

目的：构建一个能在MC3T3-E1细胞中稳定表达，并具有生物学活性的VEGF165和VEGF121基因表达载体。方法：采用RT—PCR技术从HL-60细胞中扩增人VEGF165和VEGF121基因，将获得的基因定向插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞。细胞经G418加压有限稀释筛选，采用ELISA法、Western blot法及免疫荧光法检测VEGF蛋白表达，并用MTT法检测表达的蛋白对血管内皮细胞株（HUECV304）的增殖活性影响。结果：通过基因测序表明获得的yEGF165和VEGF121与GeneBank登录的序列一致，构建的质粒分别为VEGF165／pcDNA3．1（＋）质粒和VEGF121／pcDNA3．1（＋）质粒，ELISA及Western blot检测结果均表明VEGF165和VEGF121基因转染MC3T3-E1后能在细胞中稳定表达，表达产物能明显促进HUECV304细胞生长。结论：基因转染的MC3T3-E1细胞能稳定、高效表达具有生物学活性的VEGF165和VEGF121重组蛋白。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子／增强子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法：以重组质粒pcDNA3-core（含有HCV核心蛋白编码基因）转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β－半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β－半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5．4倍。结论：HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子／增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。     

IL －1β对大鼠海马神经元细胞骨架蛋白α－tubulin和F－actin表达的影响

目的：探讨白细胞介素－1β（ IL－1β）对海马神经元细胞骨架蛋白α－tubulin、F－actin 表达的影响。方法清洁级健康成年Wistar 大鼠,雌性大鼠50只及雄性大鼠3只,体重200～250 g,进行原代海马神经元培养;实验分为8组。对照组：以生理盐水处理12 h;实验组：以0．01、0．1、1、10、20、50、100 ng／mL IL－1β处理12 h,应用蛋白免疫印迹法检测IL－1β对海马神经元细胞骨架α－tubulin、F－actin表达的变化。结果在IL－1β处理浓度为0．01 ng／mL时α－tubulin 及F－actin 表达较对照组高,0．1 ng／mL 较0．01 ng／mL 的蛋白表达水平更高。IL－1β在0．1、1 ng／mL时细胞骨架蛋白的表达与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。随着IL－1β浓度的升高,细胞骨架蛋白的表达下降,20、50、100 ng／mL处理组与对照组比较差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论低浓度（0．01、0．1、1 ng／mL）的IL－1β使细胞骨架蛋白α－tubulin 及F－actin 的表达增加;高浓度（1、10、20、50、100 ng／mL） IL－1β使细胞骨架蛋白α－tubulin及F－actin 的表达减少。     

商陆皂苷甲对 IL －1β诱导的肾小球系膜细胞ERK 通路活化的影响

目的：观察商陆皂苷甲（ EsA）含药血清对大鼠肾小球系膜细胞（ rGMC）增殖及其对IL－1β诱导rGMC的ERK1／2 mRNA、p－ERK1／2表达的影响,探讨EsA治疗肾小球系膜细胞增殖性疾病的可能机制。方法将SD大鼠随机分成对照组（0.5％羧甲基纤维素钠灌胃）,EsA（5 mg／kg）组,EsA （10 mg／kg）组,EsA （20 mg／kg）组,EsA （40 mg／kg）组,药物灌胃后,获取含药血清;取6代rGMC随机分成对照血清组,EsA （5 mg／kg）血清组, EsA （10 mg／kg）血清组,EsA（20 mg／kg）血清组,EsA（40 mg／kg）血清组,MTT法检测各组对rGMC增殖的影响;将rGMC分为对照组,IL－1β组,IL－1β＋EsA组,IL－1β＋U016组,IL－1β＋U0126＋EsA组,同步化后培养48 h, RT－PCR法检测各组ERK1／2 mRNA的相对表达量,Western blot法检测p－ERK1／2的表达并成像分析。结果EsA （5～10 mg／kg灌胃）含药血清抑制了细胞增殖（ P＜0.05,P＜0.01）;IL－1β组促进了rGMC的ERK1／2 mR-NA、p－ERK1／2表达（P＜0.05）,IL－1β＋EsA组、IL－1β＋U0126组,IL－1β＋U0126＋EsA组作用rGMC后,其ERK1／2 mRNA、p－ERK1／2表达均降低（P＜0.05）。结论 EsA含药血清（5～10 mg／kg灌胃）可显著抑制rGMC的増殖,EsA（10 mg／kg）血清组作用48 h效果最佳;EsA通过下调p－ERK1／2表达,抑制了IL－1β诱导的rGMC增殖,ERK1／2通路是EsA抑制rGMC增殖通路之一。     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。