RNA干扰抑制人肝癌细胞N-ras基因表达的研究

目的研究RNA干扰(RNAi)对BEL7402细胞的N-ras基因表达的干扰效应。方法建立装载靶向N-ras基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体;用脂质体法将此表达载体转染BEL7402细胞株,以转染空载细胞作为对照;采用RT-PCR和Western blot检测N-ras基因的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源N-ras基因在转录和转译上的表达。N-ras基因的表达抑制与BEL7402细胞的凋亡相关联。结论转染siR-NA的表达载体可明显抑制肝癌细胞株BEL7402N-ras基因的表达,并伴有细胞的凋亡。其工作的开展将为RNAi治疗、肝癌N-ras基因功能研究、新药开发提供研究基础。     

信号转导分子smad4基因表达抑制体外培养人血管平滑肌细胞的增殖

目的：探讨细胞内转化生长因子β信号通路中信号转导分子Smad4与平滑肌细胞的增殖关系。方法：实验于2003-08／10在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。①取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠，常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0．2和0．05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基，37℃，体积分数O．05 CO2进行培养，2．5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色，存活细胞数在98％以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态，抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。②观察项目：转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力的检测应用流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法凋亡检测试剂盒完成。smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因(p16、细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E)和细胞凋亡基因(半胱天冬酶2和半胱天冬酶3)表达变化应用免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测。结果：①转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法测定结果：smad4基因过表达调控人血管平滑肌细胞增殖能力下降DNA合成前期细胞明显增加[(72．33&;#177;4．35)％]，正常培养细胞DNA合成前期细胞数相对较少[(45．88&;#177;1．58)％]。②smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测结果：转染后细胞凋亡能力增加；细胞周期抑制基因p16表达增加，细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E表达下降，凋亡相关基因半胱天冬酶2和半胱天冬酶3表达增加。结论：smad4基因对血管平滑肌细胞增殖能力的抑制作用主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生而实现。转化生长因子β信号传导通路对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用除了能够有效阻滞细胞周期的演进外，还能够诱导细胞凋亡。     

靶向IGF-ⅠR的RNA干扰技术抑制胃癌细胞增殖的研究

目的 观察特异的小干扰RNAs(small interfering RNAs,siRNAs)对胃癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(Insulin-like growth factor-Ⅰ receptor,IGF-Ⅰ R)基因表达的抑制作用,研究其对肿瘤增殖的影响.方法 设计并体外合成2条靶向IGF-Ⅰ R的siRNAs,脂质体法瞬时转染MGC803细胞,转染前后均使用Western Blot法检测IGF-Ⅰ R的表达水平,MTT法检测细胞增殖,细胞计数并描记生长曲线.结果 MGC803细胞中有IGF-ⅠR的强烈表达.转染后48h,干扰组(siRNA2-L组、siRNA2-H组、siRNA1组)IGF-Ⅰ R表达抑制率分别为64.41%±4.11%、74.14%±6.15%、89.8%±4.10%;siRNA1组转染后第2-5天细胞增殖逐渐减少(分别达49.9%±1.2%、45.9%±4.4%、39.1%±5.1%、29%±4.0%);同期细胞计数分别为对照组的65.58%±4.89%、55.59%±0.82%、44.18%±3.17%、21.15%±1.1%.结论 特异的siRNAs可显著抑制胃癌细胞中的IGF-Ⅰ R基因的表达从而显著抑制细胞的增殖.     

siRNA抑制人膀胱癌T24细胞株VEGF 的表达及细胞增殖

目的探讨siRNA（small interfering RNA）对T24人膀胱癌细胞株VEGF基因表达的抑制及癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法体外构建两个针对VEGF基因的siVEGF的重组质粒，转染124细胞；应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定VEGF基因的表达，并用MTT法和流式细胞仪检测siVEGF对细胞的增殖抑制率和凋亡的影响。结果构建的两个siVEGF重组质粒分别使VEGF基因表达下调到空白组的21．02％和30．13％；control siRNA组的VEGF基因表达与空白组无明显差异。转染siVEGF后T24细胞生长受到抑制，并发生细胞凋亡，凋亡率分别为45．5％和35．9％。结论siVEGF可以有效抑制124细胞株中VEGF的表达，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。     

AGL患者端粒酶亚单位hTERT、hTEP1的表达

目的 检测急性粒细胞性白血病(AGL)患端粒酶亚单位-人端粒酶逆转录酶(hTERT)和端粒酶相关蛋白1(hTEPl)的表达情况，并观察不同的亚单位在AGL发病中的作用。方法 采用RT-PCR法检测31例AGL首治患、24例AGE，复发患、21例AGL完全缓解期患以及18例健康体检外周血白细胞端粒酶亚单位hTERT，hTEPlmRNA。结果 AGL首治患、AGL复发患、AGL完全缓解期患以及健康体检hTERTmRNA的阳性率分别为80．6％、83．3％、9．5％和5．6％。所有标本hTEPlmRNA的阳性率为100．0％。结论 与hTEPl比较，hTERT表达的上调在AGL的发生与复发中具有更重要的作用，而且可用于监测治疗是否有效以及治疗后是否复发。     

端粒酶hTERT促进肿瘤细胞侵袭与转移及其机制研究

目的观察hTERT基因修饰对人骨肉瘤细胞系U-2OS生物学行为的影响。方法采用脂质体法将克隆有人全长cDNAhTERT的真核荧光质粒(pIRES2-EGFP-hTERT)转染端粒酶阴性的人骨肉瘤U-2OS细胞,经G418筛选,免疫组化和Westorn Blot鉴定后,检测其端粒酶活性的改变、生长周期以及生物力学的变化。结果成功转染人真核荧光表达载体的U-2OS细胞能有效抵抗G418,并可有效表达hTERT蛋白,细胞内端粒酶活性明显增强,G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高,并且还明显增强了对细胞外基质的粘附力。进一步采用Transwell小孔迁移实验检测发现,hTERT/U2OS侵袭能力明显增强。结论转染hTERT基因后,U-2OS细胞内可同时通过端粒酶途径延长端粒。hTERT基因修饰可促进细胞周期进程,促使细胞从G1期→S期。通过替代途径延长端粒的肿瘤细胞在hTERT基因修饰后,增殖能力及侵袭能力明显增强。     

反转录聚合酶链式反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA

目的：研究端粒酶催化蛋白亚单位（hTERT)mRNA在肿瘤组织中的表达情况,建立一种恶性肿瘤诊断的新方法。方法：提取肿瘤组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）法进行检测。结果：76例各型肿瘤组织中66例阳性,5例恶性胸腹水全部阳性。结论：RT－PCR法检测hTERTmRNA是一种灵敏、简便的恶性肿瘤辅助诊断的新方法。     

hTERT mRNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究

目的探讨以hTERT mRNA作为靶位的肝癌治疗的可行性。方法人工合成hTERT mRNA反义寡核苷酸，导入体外培养的人肝细胞癌细胞系HepG2。提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法检测hTERT mRNA的表达量，观察反义核酸对肝癌细胞hTERT mRNA表达的抑制作用。测定细胞生长曲线，评价反义核酸药物对肝癌细胞生长的抑制作用。结果经hTERT mRNA反义寡核苷酸处理后，细胞hTERT mRNA表达水平与对照组相比显著降低（P〈0．05），为对照组表达水平的26％，而随机序列寡核酸处理组与对照细胞无显著性差异（P〉0．05）。同时，细胞经hTERT mRNA反义寡核苷酸处理后其生长明显受到抑制，而随机序列处理后与对照组细胞的生长曲线无显著性差别。结论hTERT mRNA的表达与肝癌细胞增殖活性相关，人工合成的hTERT mRNA反叉寡核苷酸可以抑制hTERT mRNA的表达，并可以进一步抑制肝癌的增殖。     

甲状腺癌中端粒酶逆转录酶及其调控因子的表达及相关性

目的探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA与其有关调控因子C—myc、突变型p53在甲状腺癌中的表达及相互关系。方法采用原位杂交检测85例甲状腺癌中hTERTmRNA的表达,采用免疫组织化学法检测C—myc、突变型p53的表达。结果①hTERTmRNA、C—myc的阳性表达与甲状腺癌的临床病理特征无关（P〉0．05）;突变型p53的表达与甲状腺癌的分化类型、有无淋巴结转移及临床分期有关（P〈0．05）,与患者年龄、性别无关（P〉0．05）;②hTERTmRNA与C—myc、突变型p53之间的相关性有统计学意义（P〈0．05）;C—myc与突变型p53之间的相关性无统计学意义（P〉0.05）。结论C—myc与突变型p53在甲状腺癌中的表达增加激活了hTERTmRNA,从而导致甲状腺癌的发生。     

维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中端粒酶活性与 hTERT,c-myc和bcl-2表达的研究

为了探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL—60细胞分化过程中端粒酶活性与hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达的变化规律及其意义，复制HL—60细胞的诱导分化模型，在分化前和分化过程中通过端粒重复序列扩增PCR—ELISA方法测定端粒酶活性，采用RT—PCR方法检测hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达水平。结果显示，在ATRA诱导HL－60细胞分化过程中，端粒酶活性水平逐渐下降，hTERT　mRNA表达下调的同时c—myc和bcl—2　mRNA表达亦下调，且hTERT　mRNA下调早于端粒酶活性水平下降。结论：全反式维甲酸诱导的HL—60细胞分化过程与端粒酶活性降低和hTERT，c—myc及bcl—2　mRNA表达下降有关。     

MACC1和hTERT蛋白在胆管癌中的表达及其意义

目的探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)和人端粒酶逆转录酶(h TERT)蛋白在胆管癌中的表达及其意义。方法收集60例胆管癌、30例胆道良性病变患者术前血清和术后病理组织标本及30例体检健康者血清标本,分别采用免疫组化染色技术和ELISA法检测组织及血清中MACC1和h TERT蛋白的表达水平,并结合临床病理资料进行统计分析。结果 MACC1和h TERT蛋白在胆管癌患者组织和血清中的表达显著高于胆道良性病变组(P0.01)。在胆管癌中,临床分期晚、伴有淋巴转移的癌组织中MACC1、h TERT蛋白表达较高(P0.05)。胆管癌中MACC1蛋白与h TERT蛋白表达的一致性分析均具有良好的相关性(r=0.699,P0.01)。血清中MACC1和h TERT单独和联合检测的ROC曲线下面积(AUCROC)分别为0.896、0.909、0.916,两者联合检测的敏感性最高(91.7%),MACC1单独检测的特异性最高(90.0%)。结论 MACC1和h TERT可以较好地鉴别胆道恶性肿瘤与良性病变。