lncRNA HOTAIR对人牙周膜干细胞增殖和骨向分化的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)HOX转录反义RNA(HOTAIR)对人牙周膜干细胞增殖和骨向分化的影响。方法 分离培养人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,并诱导成骨分化（诱导组）,随后分为pcDNA组、pcDNA-lncRNA HOTAIR组、anti-miR-NC组、anti-miR-1-3p组、pcDNA-lncRNA HOTAIR+miRNC组和pcDNA-lncRNA HOTAIR+miR-1-3p组,正常培养的hPDLSCs设为对照组。定量实时PCR检测lncRNA HOTAIR、miR-1-3p、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）的mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,Western blotting检测OCN、OPN、ALP蛋白表达,荧光素酶报告基因检测lncRNA HOTAIR和miR-1-3p的靶向结合。结果 与对照组比较,诱导组lncRNA HOTAIR表达量降低,miR-1-3p表达量增加（P<0.05）。与pcDNA组、anti-miR-NC组比较,pcDNA-lncRNA HOTAIR组、anti-miR-1-3p组细胞活...     

miR-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用及机制探讨

目的：研究微小RNA(miR)-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用，并探讨其相关机制。方法：取第3代MC3T3-E1细胞，分别转染miR-497-5p过表达质粒miR-497-5p mimics、低表达质粒miR-497-5p inhibitor和阴性对照质粒miR-497-5p NC，设为miR-497-5p mimics组、miR-497-5p inhibitor组和miR-497-5p NC组。取不做处理的细胞作为空白组。成骨诱导后14天，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；免疫印迹法检测成骨分化相关蛋白骨钙素（OCN）、I型胶原（COL-I）蛋白表达量；茜素红染色法观察矿化情况；免疫印迹法检测Smad泛素化调节因子2(Smurf2)蛋白表达量；双荧光素酶实验验证miR-497-5p与Smurf2的靶向关系。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果：与空白组、miR-497-5p NC组相比，miR-497-5p mimics组ALP活性显著增强，OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著升高，Smurf2蛋白表达量显著降低（P<0.05...     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞与人牙周膜干细胞成骨分化能力的对比研究

目的:比较人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesechymal stem ceils,hUCWJMSCs)与人牙周膜干细胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力.方法:体外培养hUC-WJMSCs和hPDLSCs.MTT法检测细胞增殖情况;成骨诱导后测定细胞的ALP活性,茜素红染色检测细胞矿化能力,Real-timePCR分析OPN和Runx2基因的表达.结果:hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs;经矿化诱导后hPDLSCs ALP表达、矿化结节形成高于hUCWJMSCs(P＜0.05);Runx2在hPDLSCs中表达高于hUCWJMSCs(P ＜0.05);而hUCWJMSCs中OPN表达高于hPDLSCs(P＜0.05).结论:hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力,hPDLSCs成骨分化能力较强.     

miR-431-5p靶向Smad4影响人牙髓干细胞增殖、分化的实验研究

目的:探讨miR-431-5p对人牙髓干细胞(DPSC)增殖、分化的调控作用及机制。方法:收集人健康第三磨牙,分离、培养DPSC,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-431-5p与野生型Smad4和突变型Smad4靶向关系。实验分成mimic-NC、miR-431-5p mimic、pc-Smad4和pc-Smad4+miR-431-5p mimic组,各组DPSC均采用脂质体转染法进行细胞转染。CCK-8实验检测DPSC细胞增殖能力,茜素红染色观察钙化结节,碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒和ALP活性检测ALP表达及活性,Western blot检测成骨分化标志物骨钙蛋白(OCN)及Smad4蛋白表达。结果:共转染miR-431-5p mimic和野生型Smad4报告基因载体后,DPSC细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);而共转染miR-431-5p mimic和突变型Smad4报告基因载体后,DPSC的荧光素酶活性无显著改变(P>0.05)。与mimic-NC组比较,miR-431-5p mimic组miR-431-5p表达上调,Smad4表达下调,细胞增殖能力...     

USP 12促进循环牵张力作用下人牙周膜干细胞的成骨分化过程

目的:探究泛素特异性蛋白酶12(USP 12)在循环牵张力刺激引起的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化中的作用.方法:原代培养健康的hPDLSCs,通过成骨、成脂及成软骨诱导分化实验检测其干细胞分化特性.使用循环牵张力刺激hPDLSCs 24 h、48 h、72 h,实时定量PCR、免疫印迹和免疫荧光实验检测USP 12的表达变化,ALP染色检测hPDLSCs的成骨分化,实时定量PCR检测成骨相关因子ALP、OGT、OPN的表达变化.结果:诱导分化试验染色显示本研究使用的原代hPDLSCs具有多向分化潜力.循环牵张力刺激hPDLSCs后,USP 12的表达均呈先升高后降低的趋势.在循环牵张力刺激下hPDLSCs发生成骨分化,ALP、OGT的表达先升高后降低,OPN逐渐升高.结论:USP 12可能促进循环牵张力作用下人牙周膜干细胞的成骨分化.     

miR-31-5p对牙髓干细胞HIF-1α/BNIP3信号通路及成骨相关因子表达的影响

目的: 探讨微小RNA-31-5p（miR-31-5p）对牙髓干细胞（DPSCs）低氧诱导因子1α（HIF-1α）/Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3（BNIP3）信号通路及成骨相关因子表达的影响。方法: 体外培养人DPSCs,分为对照组（不转染）、mimic NC组（转染negative control-miR-31-5p）、miR-31-5p mimic组（转染hsa-miR-31-5p mimic）、siRNA NC组（转染nonsense siRNA）和miR-31-5p siRNA组（转染miR-31-5p siRNA）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组DPSCs细胞中miR-31-5p、HIF-1α、BNIP3、碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录子2（Runx2）mRNA的表达情况,MTT法检测各组DPSCs细胞增殖情况,ALP活性测定试剂盒检测各组DPSCs细胞ALP活性,蛋白印迹（WB）法检测各组DPSCs细胞中HIF-1α、BNIP3、Runx2蛋白的表达情况。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组、mimic NC组相比,miR-31-5p mimic组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,ALP染色明显减弱,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与对照组、siRNA NC组相比,miR-31-5p siRNA组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.05）,ALP染色明显增强,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论: miR-31-5p可以激活HIF-1α/BNIP3信号通路,抑制DPSCs细胞的成骨相关因子表达。     

USP 12促进循环牵张力作用下人牙周膜干细胞的成骨分化过程

目的:探究泛素特异性蛋白酶12(USP 12)在循环牵张力刺激引起的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化中的作用.方法:原代培养健康的hPDLSCs,通过成骨、成脂及成软骨诱导分化实验检测其干细胞分化特性.使用循环牵张力刺激hPDLSCs 24 h、48 h、72 h,实时定量PCR、免疫印迹和免疫荧光实验检测USP 12的表达变化,ALP染色检测hPDLSCs的成骨分化,实时定量PCR检测成骨相关因子ALP、OGT、OPN的表达变化.结果:诱导分化试验染色显示本研究使用的原代hPDLSCs具有多向分化潜力.循环牵张力刺激hPDLSCs后,USP 12的表达均呈先升高后降低的趋势.在循环牵张力刺激下hPDLSCs发生成骨分化,ALP、OGT的表达先升高后降低,OPN逐渐升高.结论:USP 12可能促进循环牵张力作用下人牙周膜干细胞的成骨分化.     

血小板衍生生长因子BB对牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的：观察血小板衍生生长因子BB（platelet derived growth factor BB, PDGFBB）基因修饰人牙周膜干细胞（human periodontal stem cells, hPDLSCs）的生物学特性,探讨PDGFBB对hPDLSCs细胞增殖、迁移及诱导成骨的影响。方法：分离并扩增hPDLSCs,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志和成骨诱导分化能力。通过慢病毒载体介导PDGFBB基因转染hPDLSCs,转染后,采用CCK-8及划痕实验检测其对细胞增殖、迁移的影响。利用实时荧光定量PCR分析PDGFBB基因转染后hPDLSCs细胞内成骨相关基因和成血管相关基因VEGF mRNA的表达水平。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果：采用组织块培养及有限稀释法成功获得hPDLSCs。PDGFBB转染hPDLSCs后,细胞形态良好,与空病毒组和未转染组相比,转染组细胞增殖及迁移能力显著上升,OPN、COL-1和VEGF mRNA表达水平显著上调（P<0.05)。结论：慢病毒载体能在体外将PDGFBB基因转入hPDLSCs,获得持续、稳定表达。PDGFBB可促进hPDLSCs细胞的增殖和迁移,上调成骨和成血管相关基因的表达。     

过表达甲基转移酶样3修复炎症来源牙周膜干细胞的成骨能力

目的探讨N⁶-甲基腺嘌呤（m⁶A）修饰与甲基转移酶样3（METTL3）在牙周膜干细胞（PDLSC）成骨分化和成脂分化中的作用。 方法使用流式细胞术、细胞集落形成实验分别鉴定PDLSC的表面标志物和增殖能力。通过茜素红染色和油红O染色分别检测PDLSC的成骨和成脂分化潜能。在人牙周膜干细胞（hPDLSC）和炎症来源牙周膜干细胞（pPDLSC）中分别构建METTL3过表达和敲低模型,成骨诱导一定时间,通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）、茜素红染色和油红O染色分别在mRNA水平、蛋白水平和宏观水平检测成骨和成脂的变化。两样本比较使用独立样本t检验,多组样本比较使用单因素方差分析。 结果（1）流式细胞术结果显示,hPDLSC和pPDLSC均阳性表达CD29（100.0%,98.0%）、CD105（100.0%,99.5%）和CD146（31.5%,17.8%）,阴性表达CD34（1.3%,0.4%）和CD45（1.4%,0.4%）。（2）细胞集落形成实验结果显示,hPDLSC和pPDLSC的集落形成数量分别为55±5和72±8,hPDLSC的细胞增殖能力较pPDLSC低（t = 3.16,P = 0.034）。（3）茜素红染色和油红O染色说明,两种细胞均具有成骨和成脂分化能力,hPDLSC具有更强的成骨分化能力（t = 27.77,P<0.001）,而pPDLSC具有更强的成脂分化能力（t = 5.02,P = 0.007）。（4）成骨诱导培养7 d后的慢病毒转染模型中,METTL3过表达组比过表达对照组的成骨关键基因Runx2的mRNA表达水平高,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组的表达量是3.63 ± 1.15和1.61 ± 0.38,分别是其过表达对照组的3.39倍（t = 3.777,P = 0.020）和1.71倍（t = 2.948,P = 0.042）;而在METTL3敲低组较敲低对照组低,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组的表达量是0.16 ± 0.03和0.26 ± 0.07,分别是其敲低对照组的0.15倍（t = 9.669,P<0.001）和0.26倍（t = 8.767,P<0.001）。同样地,Runx2的蛋白表达水平也发生相同改变。将转染后的细胞进行21 d的成骨诱导培养后进行茜素红染色,结果显示METTL3过表达组较过表达对照组染色深且钙化结节较大,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是28.47% ± 3.82%和8.55% ± 0.43%,分别是其过表达对照组的1.78倍（t = 5.012,P = 0.007）和1.76倍（t = 7.293,P = 0.002）,而在METTL3敲低组较敲低对照组染色浅且钙化结节较小,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是6.36% ± 2.00%和3.78% ± 0.56%,分别是其敲低对照组的0.35倍（t = 4.444,P = 0.011）和0.43倍（t = 5.337,P = 0.006）;将转染后的细胞进行21 d的成脂诱导培养,再进行油红O染色,结果显示脂滴的大小及数量在METTL3过表达组较过表达对照组少,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是0.89% ± 0.11%和1.10% ± 1.15%,分别是其过表达对照组的0.24倍（t = 5.454,P = 0.006）和0.49倍（t = 2.935,P = 0.043）,而在METTL3敲低组则比敲低对照组的脂滴更大且多,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是3.60% ± 1.08%和5.34% ± 1.31%,分别是其敲低对照组的1.94倍（t = 2.794,P = 0.049）和2.93倍（t = 4.131,P = 0.015）。 结论pPDLSC的METTL3表达水平低于hPDLSC;METTL3的过表达可促进hPDLSC和pPDLSC的成骨分化,并抑制两者的成脂分化。     

P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用

目的：探讨P2X7受体（P2X7 receptor,P2X7r）在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法：选取就诊于贵州中医药大学第一附属医院的健康青年患者因正畸需要而拔除的前磨牙为实验材料,分离、培养人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）。取第4代hPDLSCs,分为A、B、C、D 4组,A组用常规培养液培养,B组用成骨诱导液培养,C组用成骨诱导液+100 nmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）溶液培养,D组用成骨诱导液+100 nmol/L P2X7受体特异性拮抗剂KN-62培养。7 d后,采用茜素红染色观察各组hPDLSCs成骨效果,采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）检测各组hPDLSCs成骨相关因子骨钙素（osteocalcin,OCN）、RUNX2 mRNA的表达量,采用RT-PCR检测各组hPDLSCs中P2X7r mRNA表达。采用SPSS 22.0软件包对结果进行统计学分析。结果：茜素红染色结果显示,B组和C组hPDLSCs细胞形态发生显著变化,逐渐由不规则形变为方形,出现灰白色钙化小结节。结节多呈板层状圆形或椭圆形团块,C组灰白色钙化小结节显著多于B组,而A组和D组钙结节量均很少。B、C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于A组（P<0.05）,C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于B组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著低于B、C组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量与A组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论： P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中发挥正调节作用。P2X7受体被ATP激活后,可促进人牙周膜干细胞成骨分化,这为临床上治疗牙周炎提供了新的方向。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的 人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

低强度高频振动对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究低强度高频振动（low-magnitude high frequency vibration,LMHFV）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、迁移、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养hPDLSCs;流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物;加载LMHFV（加速度=0.3 g,频率=40 Hz,时间=15 min/24 h）刺激后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过qRT-PCR、Western免疫印迹检测成骨相关基因、蛋白表达水平,通过茜素红染色检测细胞成骨分化能力。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 加载振动刺激后,hPDLSCs的增殖能力增强,迁移能力上升;RUNX2、ALP、Col-1、OCN的mRNA表达量和蛋白表达量均上升,茜素红染色结果与qRT-PCR、Western免疫印迹结果一致。结论 LMHFV可提高hPDLSCs的增殖、迁移能力和成骨分化能力。