人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.     

阿片肽结合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建阿片肽结合蛋白的真核表达载体。方法：从人卵巢上皮组织中提取总RNA进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,扩增出阿片肽结合蛋白（OPCML）基因片段,与真核表达载体pcDNA4/HisMaxB连接,得到重组载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML,并酶切鉴定和测序。结果：真核表达载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML中OPCML基因的序列和插入方向均正确。结论：本实验成功构建了阿片肽结合蛋白真核表达载体。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法扩增人转化生长因子基因，与GFP真核表达载体连接，构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体，并用限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序，证实新质粒的构建成功。结论：应用RT-PCR方法扩增目的DNA片段，简单快捷；双酶切定向克隆可以保证构建一步到位，免去正反向重组体筛选的问题。     

凝血栓蛋白-1I型重复序列真核表达载体的构建

目的构建凝血栓蛋白-1I重复序列真核表达载体.方法采用RT-PCR技术,从人胎儿肺组织中扩增凝血栓蛋白-1 I型重复序列基因,通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定及测序.结果获得了预期的扩增产物——凝血栓蛋白-1 I型重复序列基因,测序结果经GenBank分析,一致性为99%.结论成功构建了PcDNA3.1+/TSP-1 I型重复序列真核表达载体.     

组织型纤溶酶原激活因子基因真核表达质粒的构建及其体外表达研究

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的新型真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA,并观察其在人脐静脉内皮细胞株(hUVEC)中的表达情况。方法将t-PA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)中,经脂质体介导将pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA导入hUVEC,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测t-PA基因在转染细胞内的转录水平,免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞t-PA蛋白表达,底物发色法检测转染细胞t-PA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将t-PA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,转基因组、空载体组、转绿色荧光蛋白组和空白对照组hUVEC t-PA mRNA相对含量分别(0.92±0.22)(、0.32±0.17)(、0.35±0.17)和(0.27±0.17),转t-PA基因组明显高于对照各组,其细胞培养上清t-PA活性分别为(48.90±8.06)、(5.44±1.09)(、5.17±0.95)和(5.01±1.03)U/106细胞.24h,转t-PA基因组t-PA活性明显高于各对照组(均P<0.01)。用抗Myc标签抗体可检测到转t-PA基因组外源性蛋白质表达,对照组则为阴性。结论成功构建pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA基因新型真核表达载体,并能在hUVEC中表达,从而为血栓性疾病的基因治疗研究奠定了基础。     

转录因子Kaiso真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定转录因子Kaiso的表达质粒pEGFP-Kaiso.方法 采用PCR的方法扩增pCS2-Kaiso中人Kaiso的全长序列,克隆至载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-Kaiso,以酶切及基因测序方法鉴定重组质粒的准确性.利用LipofectamineTM 2000将重组质粒转染至肺癌细胞系A549,24h后荧光显微镜观察绿色荧光信号,48 h后Western blot鉴定Kaiso蛋白表达变化.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入的DNA片段长度约为2 022 bp,与预期Kaiso基因片段大小相同.转染pEGFP-Kaiso重组质粒后,荧光显微镜观察到明确的绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光信号,Western blot证实转染pEGFP-Kaiso质粒后的Kaiso蛋白表达量显著上调(P＜0.05).结论 成功构建了人Kaiso基因真核表达载体,为深入研究Kaiso的生物学功能提供了有力的实验工具.     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

  目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达?方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)mRNA,反转录为cDNA?PCR 扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体?转染HUVEC,Western blot 检测转染后HMGB1基因的表达改变?结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达?结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中     

胰高糖素样肽-1基因荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆大鼠胰高糖素样肽-1（GLP-1）的编码基因，构建荧光真核表达载体，为研究GLP-1与糖尿病的相关性奠定实验基础。方法：用RT-PCR方法从大鼠胰腺组织中扩增GLP-1的编码基因，克隆至PMD18-T载体并测序，结果正确后亚克隆至荧光真核表达载体pEYFP-N1中。结果：测序证实从胰腺中扩增出的GLP-1编码基因的序列及读框全部正确，重组质粒pEYFP-GLP-1经酶切后产生与理论预期长度相符的片段。结论：克隆了大鼠GLP-1的编码基因，成功构建了荧光真核表达载体pEYFP-GLP-1。     

FTH1真核表达载体的构建与鉴定

目的构建携带人铁蛋白重链多肽1（FTH1）基因的真核表达载体pCMV－Myc-FTH1,为研究FXR1P与FTH1体内相互作用奠定基础。方法以人胎脑cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增FrH1基因片段,将扩增片段经EcoRI和XhoI双酶切后克隆到同样经EcoRI和XhoI双酶切的pCMV－Myc载体,酶切鉴定阳性克隆并进一步测序鉴定。结果成功构建了pCMV－Myc—FTH1重组真核表达载体。结论pCMV－Myc—FFH1重组真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1P与VrH1相互作用奠定了基础。对研究FXR1在脆性x综合征中的作用机理提供了依据。     

成熟型Smac真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞中的表达

目的 构建成熟型Smac基因真核表达载体．探讨成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡的可能性。方法 以Xba Ⅰ和Bam HⅠ双酶切质粒pET15b-Smac．回收酶切释放基因片断．定向插入以Xba Ⅰ和BamHⅠ双酶切的真核表达质粒pcDNA3．1（-）中．构建含有成熟型Smac基因的真核表达载体pcDNA-MT Smac．测序鉴定重组的质粒。构建的质粒转染膀胱癌T24细胞．在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导下以原位未端转移酶标记法（TUNEL）检测凋亡率。结果 以T7引物测序证实得组的质粒pcDNA-MT Smac含有成熟型Smac基因。空白对照组、50ng／ml TRAIL处理组、转染Smac组和转染Smac后50ng ml TRAIL处理组的凋亡率分别为1．6％、20．2％、1．7％和35．7％．未经TRAIL诱导．T24细胞及转染了成熟型Smac的T24细胞间凋亡率差异无显著性意义（P〉0．05）．然而作TRAIL的诱导下．转染了成熟型Smac的T24细胞凋亡率明显高于术转染细胞．其差异有级显著性意义（P〈0．01）。结论 成功构建了含有成熟型Smac基因的真核表达载体．并证实该基因可以促进TRAIL诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡．为研究成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡提供了实验依据。     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。