诱导人T细胞对猪抗原免疫耐受的体外实验研究

目的：探讨诱导人Ｔ细胞对猪抗原免疫耐受的状况。方法：通过建立人幼稚淋巴细胞与猪抗原递呈细胞混合培养模型,以淋巴细胞增殖实验及毒性实验,ＤＮＡ分析,淋巴细胞表面标志检测等手段,观测了幼稚淋巴细胞分化,发育过程中对异种负调细胞疫苗初次接触与再次刺激的免疫应答状况的变化。     

供体脾细胞输注维持异种移植耐受的研究

目前 ,异种移植是领域的热点 ,但要在临床开展它 ,必先克服异种间强烈排斥反应[1] ,免疫抑制剂使排斥反应大大减弱 ,但存在并发症 ,需诱导一种持久稳定无需药物的造血干细胞嵌合体维持异种抗原特异耐受来解决排斥反应。有报道[2 ] 建立嵌合体模型 ,但随时间受鼠嵌合率消失 ,特异耐受减弱 ,本实验研究建立小鼠→大鼠混合嵌合体模型后输供体脾细胞 ,测定嵌合率和皮肤移植等来检测是否供体脾细胞能维持耐受。1　材料与方法1 1　材料　 6～ 8周龄BALB/c和C5 7BL/ 6小鼠 ,4～ 6周龄SD大鼠 ,第一军医大学实验动物中心提供 ;CTX江苏恒瑞医药股…     

小鼠皮肤移植耐受诱导及微嵌合体检测

目的　探求简便易行、安全有效、有临床应用前景的移植耐受诱导方法，研究微嵌合体的形成情况及其与移植耐受的关系。方法　雄性ＢＡＬＢ／ｃ 和雌性Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠作为皮肤移植的供体和受体，移植前对受体小鼠单独或联合应用５Ｇｙ（５００ｒａｄ ，１Ｇｙ ＝ １００ｒａｄ） 全身照射，０ ．１ ｍｌ 抗淋巴细胞血清注射，３ ×１０７ 供体骨髓细胞静脉输注，１５０ｍｇ／ｋｇ 体重环磷酰胺腹腔注射。应用多聚酶链式反应（ＰＣＲ） 检测微嵌合体的形成。结果　单纯照射不能延长移植物的存活，也没有微嵌合体形成，而其它各实验组的皮肤移植物存活时间均较对照组明显延长，混合淋巴细胞反应和迟发型超敏反应也表现为供者特异性的降低，多种组织的微嵌合体检查均呈阳性。结论　采用比较温和的非照射的预处理方法，也可获得一定程度的免疫耐受，达到延长移植物存活的目的；移植前输注供体骨髓细胞能够促进微嵌合体的形成及移植物的存活。     

同种异体大鼠嵌合体动物模型的建立及意义

目的:探讨建立同种异体大鼠嵌合体动物模型的方法,初步研究嵌合体与耐受的关系。方法:采用两种诱导方法处理受体Wistar大鼠(♀) :Ⅰ组大鼠亚致死TBI(11Gy) ;Ⅱ组大鼠TBI(7Gy) ,两组均在4小时内输入SD大鼠(♂)BMC(8×10 7) ,Ⅱ组于2天后腹腔注射CTX(5 0mg kg)。分别于BMT后2 0、4 0天通过PCR方法检测SD大鼠源性BMC在Wistar大鼠体内植活情况,并通过皮肤移植、DTH和MLR检查,判断其耐受情况。结果:经上述处理两组大鼠外周血均可测出SD大鼠源性嵌合体,皮肤移植、DTH和MLR检查显示对SD大鼠产生特异性耐受,但Ⅰ组大鼠生存情况明显不如Ⅱ组。结论:应用7GyTBI +腹腔注射CTX(5 0mg kg) +供体BMT可成功建立同种异体大鼠嵌合体模型,诱导特异性免疫耐受。     

小鼠→大鼠异种移植耐受模型的建立

目的：用非清髓方法建立小鼠→大鼠混合嵌合体模型，探讨免疫耐受机制。方法：给SD大鼠亚致死全身照射(TBI)后，4h内输入Balb／c小鼠骨髓细胞(BMC)，2d后腹腔注射环磷酰胺(CTX)，分别于BMT后30、60和90d，检测小鼠源性BMC在大鼠体内植活情况。通过皮肤移植、迟发超敏反应(DTH)和混合淋巴细胞反应(MLR)检查，探讨其耐受机制。结果：经处理大鼠外周血可测出小鼠源性嵌合体，皮肤移植、DTH和MLR检查显示对Balb／c小鼠产生特异性耐受，且较持久。结论：应用7．5Gy TBI 腹腔注射50mg／kg CTX 供体BMT、可成功建立小鼠→大鼠混合嵌合体模型诱导特异性耐受，嵌合体与耐受有关系。     

从健康人外周血中建立异种抗原特异性的T细胞系初探

为了探讨异种器官移植中Ｔ细胞参与的免疫排斥机理，从健康人外周血中试行建立识别猪淋巴细胞怕特异的Ｔ细胞系方法研究。方法：通过照光致弱的猪外周血单个核细胞反复刺激的人Ｔ淋巴细胞，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法筛选特异性增殖的Ｔ细胞。结果获得２株为ＴＣＲαβ＾＋ＣＤ３＾３＋ＣＤ８＾＋细胞，另１株为ＴＣＲαβ＾＋ＣＤ３＾＋、ＣＤ４＾＋细胞。结论：健康人外周血中有识别异种抗原特异性的Ｔ细胞系，但出现频率较低。     

未成熟树突状细胞诱导异基因嵌合体的形成

目的：证实供体来源的未成熟树突状细胞（imDCs）主支免疫受体小鼠后可诱导形成基因嵌合体。方法：应用供体（C57BL／6）来源的骨细胞在体外培养出imDCs，灭活后静脉输注受体小鼠（BALB／c），并于输注后不同时间输注供体来源的骨髓细胞，检测异基因嵌合体的形成。同时比较imDCs一次免疫与多次免疫对诱导嵌合体形成的影响。结果：在imDCs免疫后3d输注骨髓细胞可诱导基因嵌体合体的形成，并持续100d以上；在免疫后5d注射骨髓细胞只能形成短暂的（＜21d）、低水平（＜1％）的嵌合状态；7d后则完全不能形成嵌合。应用一次和多次imDCs免疫均能诱导形成异基因嵌合体，且维持时间均大于100d，但其嵌合程度有显著性统计学差异（P＜0．05）。结论：应用供体来源的imDCs主动脉免疫受体可诱导形成异基因嵌合体。     

供体脾脏中的T细胞在移植耐受诱导中的作用

目的：探讨供体脾脏中的T细胞在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中的作用。方法：在“细胞后环磷酰胺”方法的基础上输注供体脾细胞或去除T细胞的供体脾细胞,然后进行皮肤移植。观察皮肤存活情况并探讨耐受形成机制。结果：脾细胞输注后供体皮肤存活明显延长,而去除T细胞后皮肤存活不能被延长。克隆不应答、抑制细胞和嵌合体的形成等机制都参与了耐受形成。结论：供体脾脏中的T细胞在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中具有重要作用,它可能和宿主中克隆不应答的发生、抑制细胞的产生或活化及嵌合体的维持有关。     

未成熟树突状细胞诱导建立异基因嵌合体及延长移植物存活的可能机制

目的：研究应用供体来源的未成熟树突状细胞(inDCs)注射受体小鼠后，诱导形成异基因嵌合体及延长移植物存活的机制。方法：(1)应用供体(C57BL／6)来源的骨髓细胞，在体外培养出imDCs，灭活后体内输注或体外直接刺激受体小鼠(Balb/C)的脾细胞，观察脾细胞对供体细胞的应答反应；(2)取已建立异基因嵌合体并有效延长移植物存活的受体小鼠的脾细胞，观察其对供体细胞刺激的应答反应；(3)通过半定量RT—PCR检测不同免疫状态下Th1／Th2型细胞因子的表达情况。结果：应用imDCs体外预刺激脾细胞或体内注射imDCs受鼠的脾细胞，均呈现对供鼠脾细胞刺激的特异性低应答，这种低应答主要出现在受鼠脾细胞在供鼠脾细胞刺激后的72小时内；建立异基因嵌合体并延长移植物存活的受鼠对来自供鼠脾细胞的刺激也表现为低应答，而对于无关第三者脾细胞的刺激仍保持较高水平，二者比较，统计学处理有显著性差异(P＜0．05)；在诱导形成异基因嵌合体及延长移植物存活的过程中，一定程度上显示出Th1／Th2模式的偏移。结论：应用供体来源的imDCs注射给受体，诱导形成异基因嵌合体和延长移植物存活的机制可能与imDCs诱导受体T细胞无能有关，而且此过程中在一定程度上表现为Th1向Th2方向的免疫偏移。     

输注人PBMC建立“人-鼠”异种移植物抗宿主病模型1

目的:摸索X-GVHD模型的合适小鼠品系,建立稳定的“人-鼠”X-GVHD模型。方法:选取了裸鼠、NOD/SCID经亚致死剂量γ射线全身照射后,腹腔输注健康人外周血单核细胞(PBMC)建立异种X-GVHD模型。通过检测人T细胞在模型鼠外周血、组织、器官中的浸润情况等指标(采用流式细胞术和免疫组化技术),比较两种模型鼠中人免疫细胞的浸润率和各组生存时间,从而确定建立X-GVHD模型的合适小鼠品系,并摸索人PBMC的输注途径和合适细胞量,以及观察免疫细胞表型变化与功能的最佳时间窗口。结果:NOD/SCID鼠更适合诱导“人-鼠”X-GVHD模型的小鼠;腹腔输注途径和尾静脉输注途径对建立“人-鼠”X-GVHD模型无明显差异;腹腔输注5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。在采用优化后的实验条件建立模型中,监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间窗口为7~11 d;模型鼠的平均生存时间为(14.16±1.77)d。结论:NOD/SCID鼠通过腹腔注射5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型,7~11 d为监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间。     

小型猪实验性慢性心肌缺血模型的建立

目的: 血管新生是缺血性心脏病治疗的新途径。本研究旨在探索建立猪的慢性心肌缺血动物模型，并通过选择性冠状动脉造影及病理检查来证实。方法: 选用小型猪，复合麻醉、开胸、分离左回旋支近段，并安置Ameroid环，利用环内物质吸水均匀膨胀，造成动脉慢性闭塞。第3周及第5周行冠状动脉造影，观察血管狭窄及侧支血管生成的程度。5周后处死动物，行苏木精·伊红染色及免疫组化检查，观察组织病理变化及心肌新生血管密度。结果: 最终连续造模成功4例。冠状动脉造影显示，第3周左回旋支近段狭窄明显，第5周完全闭塞并生成侧支血管Ⅱ级。心肌组织的病理改变为慢性心肌缺血所致，缺血区新生血管密度明显大于梗死区及正常组织区。结论: 应用Ameroid建立慢性心肌缺血动物模型，实验结果均一、稳定，手术成功率高。模型已生成一定程度的侧支循环，可用于血管新生的基础研究。     

DMD模型鼠基因型鉴定及其肌组织病理学与超微结构研究

目的:探讨DMD动物模型dko小鼠的基因型鉴定方法及其肌组织的病理学与超微结构情况。方法:运用序列特异性引物PCR-SSP技术鉴定杂合子种鼠的子代基因型,并对子代dko小鼠的骨骼肌组织冰冻切片进行HE染色和dystrophin/utrophin的SABC-Cy3荧光免疫组织化学检测以及肌组织的透射电镜观察。结果:112只子代鼠中,mdx小鼠28只,dko小鼠26只,杂合子鼠58只,按百分比计算,分别占25.0%、23.2%、51.8%,基因型鉴定结果符合孟德尔遗传规律;dko小鼠肌组织HE染色显示细胞大小形态不均,轮廓变圆,核中移,肌间隙变宽,有炎症细胞浸润与结缔组织增生现象;免疫荧光检测肌膜未见有dystrophin/utrophin表达;电镜观察有肌膜断裂不完整、膜与膜下组织分离并水肿、肌原纤维结构松散、结缔组织增生及炎症细胞浸润等现象。结论:PCR-SSP技术鉴定子代鼠基因型快捷准确;dko小鼠的病理生理学表现与DMD极为相像,是DMD临床治疗研究的理想疾病动物模型。     

在体皮层扩散性抑制动物模型的建立

目的：用KCl和针刺分别在鼠皮层诱导皮层扩散性抑制（CSD），建立大鼠CSD动物模型，为进一步研究奠定基础。方法:采用Spangue-Dawley大鼠25只，随机分为针刺诱导组（n=10）、KCl诱导组（n=10）和NaCl对照组（n=5），在大鼠颅骨上分别钻磨出诱导窗口和观测窗口，分别在诱导窗口用针刺和滴加KCl诱导大鼠脑CSD，对照组在诱导窗口滴加NaCl，并用电生理记录和光学成像的方法来描记CSD的产生与传播，并分析其特点。结果:针刺诱导组和KCl诱导组在观测窗口均可以观察到向外周扩散的弧形波，观测窗口均可以观察到明暗相间的弧形波向远处扩散，针刺诱导的CSD波呈典型的同心圆样向四周均匀扩散，KCl诱导的CSD波则是呈不规则的圆弧形波向外周扩散，针刺组每次只诱发1次CSD波，而KCl组则可以诱导多次CSD波。在产生CSD波的同时，伴随着去极化电位的产生，而在NaCl对照组没有这一现象的发生。结论:用本方法制作CSD动物模型，简单易行，可以用OISI直观观测CSD的产生和发展，并与电生理观测到的去极化波一致，适于在体研究CSD，为进一步研究CSD的发生机制及其可能的作用提供了一种有效手段。     

动脉粥样硬化并发血栓形成家兔模型的研究

目的： 建立AS并发血栓形成的动物模型，为开展急性冠脉综合症（ACS）发病机制的研究奠定一定的实验基础。 方法： 实验组20只雄性新西兰兔，高胆固醇喂养18周，建立AS性兔模型；另取5只雄性新西兰兔用普通颗粒饲料喂养作为对组照。18周末采用血管紧张素Ⅱ 30 μg/kg静脉注射诱导，24 h后重复静脉注射1次。观察两组血脂、动脉壁斑块、血栓形态和AS血栓形成模型成功率。 结果： 实验组第9、18周血清TC、LDL-C水平明显高于对照组；实验组AS模型成功率为100%，而并发血栓的形成率为60％，可见血栓形成处血管内膜被掀起及内膜的连续性中断，伴有相应节段中膜的断裂、坏死和组织脱落，血栓与斑块相邻，而对照组未见血栓形成。 结论： 血管紧张素Ⅱ可导致血流动力学异常和血管壁结构的破坏，能成功诱导AS并发血栓形成模型，为ACS发生、发展和干预提供一个方便可行的研究方法。     

EL9611红白血病小鼠急性GVHD动物模型的建立

目的: 建立EL9611红白血病小鼠急性移植物抗宿主病(GVHD)的动物模型。方法: 同种异基因骨髓移植(allo-BMT)以C57BL/6(H-2^b)鼠为供鼠,BALB/c(H-2^d)为受鼠。设白血病组(n=10)、照射对照组(白血病鼠照射后不进行allo-BMT,n=4)、GVHD组(白血病鼠照射+allo-BMT,n=10)及正常对照组(n=4)。白血病组采用每只BALB/c鼠尾静脉输注2×10⁶个EL9611红白血病细胞建立红白血病动物模型;GVHD组于接种白血病细胞7 d后行总剂量为8.0 Gy的1次性 γ射线全身照射(TBI),照射后5 h内每只小鼠尾静脉输注C57BL/6鼠骨髓细胞2×10⁶个＋脾细胞1×10⁷个,建立EL9611红白血病小鼠的急性GVHD动物模型。观察小鼠体位、皮毛、大便等临床表现,病理检查肝脾、皮肤、小肠、外周血和骨髓,计算生存率。结果: 白血病组生存时间(14.5±2.1) d ,生存时间与GVHD组相比P<0.01,死亡率100％,无自发缓解,死亡时肝脾肿大(肝重2.40 g±0.48 g,脾重0.84 g±0.20 g,与正常对照组比P<0.01),外周血WBC升高 ,病理检查示组织正常结构破坏,白血病细胞浸润。照射对照组生存时间为(9.0±0.7) d,生存时间与GVHD组和正常对照组相比差异显著(P<0.01),死亡率100％,病理检查显示造血衰竭。GVHD组生存时间为(32.0±3.2)d,生存时间与其它各组相比P<0.01,死亡率100％,allo-BMT后第10-13 d出现症状,临床表现和病理检查符合Ⅰ到Ⅱ度GVHD的改变。结论: 采用EL9611红白血病细胞(2×10⁶/鼠)静脉输注的方式可成功建立EL9611红白血病动物模型;接种EL9611红白血病细胞第7 d行TBI +allo-BMT可成功建立EL9611红白血病小鼠的急性GVHD动物模型。     

兔激素性股骨头坏死模型的建立

目的： 建立兔激素性股骨头坏死的模型。方法: 新西兰大白兔24只,分为正常对照组（N）、模型2周（M2)组和模型4周(M4)组。使用内毒素+激素建立股骨头坏死的动物模型。给药后2周和4周取双侧股骨头观察骨小梁和髓腔的组织形态学变化。结果: 模型组骨小梁内骨细胞核固缩,空骨陷窝增加,小梁间脂肪细胞增多、增大;髓腔内脂肪细胞增多、增大,造血组织明显减少。结论: 小剂量内毒素+激素成功诱导兔股骨头坏死模型,这种动物模型操作简单,稳定可靠,重复性好,为研究激素性股骨头坏死的发病机制和治疗方法提供了帮助。     

兔经冠状动脉自体骨髓干细胞移植模型

目的： 建立扩张型心肌病（DCM）兔经冠状动脉途径自体骨髓单个核细胞（BMNNCs）移植模型，并初步探讨其可行性。方法: 雄性新西兰兔经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立DCM模型，将存活兔随机分为冠脉移植组（n=10）和对照组（n=10），移植前测定对照组血流动力学指标作为基线资料，分离自体BMNNCs，［99mTc］-MIBI标记，分别通过冠状动脉（冠脉移植组）和耳缘静脉（对照组）输注，心肌灌注显像间接评价BMNNCs在心肌组织中的生物学分布；术后4周测定血流动力学指标，评价心功能的改变。结果: ［99mTc］-MIBI心肌灌注显像提示冠脉移植组BMNNCs更容易在心肌组织中富集，对照组植入细胞主要分布在肝组织内；与耳缘静脉输注比较，冠脉移植组心功能改善更为显著(P＜0.01)。结论: DCM兔经冠脉途径自体BMNNCs移植利于植入细胞在心肌组织中富集，提高移植效率，为干细胞的基础研究提供理想的移植模型。     

新生大鼠高胆红素血症及脑病模型的建立与评价

 目的：建立新生SD大鼠高胆红素血症和胆红素脑病模型并评价其效果。方法：将3 日龄 SD新生大鼠按窝系和体重随机均分为7组,分别经腹腔注射生理盐水（Con）以及胆红素6.25 μg/g（T1）、12.5 μg/g（T2）、25 μg/g（T3）、50 μg/g（T4）、100 μg/g（T5）和200 μg/g（T6）,每天2次,共3 d。末次注射12 h后拍照、称重、取材,称量胃内容物重量,计算胃内容物指数和肝/体重比,测定血清总胆红素和游离胆红素浓度,检测脑组织的含水量、胆红素含量和ATP含量,HE和尼氏染色进行形态学检测。结果：随着注射次数和剂量的增加,新生鼠的一般表现逐渐变差,皮肤和黏膜黄染加重,活动次数逐渐减少,体重增长被抑制,T6组出现体重负增长;死亡率逐渐升高,T6 组72 h死亡率接近100%,停止注射后观察1周,T4和T5组死亡率继续升高;与Con和T1组相比,T3~T5组胃内容物重量及其指数显著降低（P<0.05）;T5 组肝/体重比显著升高（P<0.05）;血清总胆红素、游离胆红素和脑组织总胆红素的浓度在T1~T5组逐渐递增;各组大鼠脑组织的含水量没有差异;脑组织ATP含量在T1~T5组先升高后降低,T3组达高峰,与Con 组相比,T4 组和T5 组显著降低(P<0.05)。HE染色结果显示：随着胆红素浓度升高,各组大鼠大脑皮层神经元数量逐渐减少,T4和T5组神经元结构紊乱,细胞肿胀,部分细胞核染色质致密浓缩。尼氏染色显示,随着胆红素浓度增多,神经元胞体逐渐变小,尼氏小体减少、染色逐渐变浅,T4和T5组部分神经元溶解甚至消失。结论：新生3 日龄SD大鼠腹腔注射胆红素12.5、25、50和100 μg/g,每天2次,注射3 d可致高胆红素血症,50和100 μg/g可引起胆红素脑病的发生。     

HBV慢性感染者免疫耐受相关临床与病理探讨

目的 了解HBV慢性感染免疫耐受相关的临床与病理特征,探讨临床免疫耐受期患者的诊断.方法 对135例既往未出现过肝功异常的HBV慢性感染患者进行分析,了解他们年龄、性别、血清HBV DNA水平,肝功及肝脏病理情况.结果 本组患者平均年龄(22.61±8.95)岁,大部分肝脏损害轻微(99/135),病理损害轻微组(G≤1和S≤1)与病理损害明显组(G≥2或S≥2)在年龄、乙型肝炎家族史、性别等无明显差异,但在ALT≥30及ALT＜30两组患者中,高水平的ALT组病理损害明显的患者更多见(20/41及16/94);血清HBVDNA≥107拷贝/ml与血清HBVDNA＜107拷贝/ml两组患者比较,低水平的HBVDNA组病理损害明显的患者更多见(7/13及29/108).结论 HBV慢性感染HBVDNA、HBeAg阳性、既往肝功一直正常的患者,一般病理损害轻微,但尚有部分患者肝脏损害较明显,说明这部分人群不是都处于免疫耐受期,监测肝功及HBV DNA水平有助于免疫耐受的判断,特别是肝组织活体穿刺是指导诊治的有效办法.