用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色改良法检测膜蛋白

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)一般采用考马斯亮蓝染色,这种染色步骤简单但敏感度低,样品中一些微量的蛋白质组分往往不能显示。为了提高检测蛋白质的能力,也有用放射性同位素标记蛋白质,再结合放射自显影;此法检测的灵敏度高但手续繁杂、过程很长。1979年Switzer介绍一种银染色法,其灵敏度虽可与放射自显影媲美;但操作繁杂、较难掌握且硝酸银用量大。为此我们对PAGE银染色法作了改进,使其操作简化、重复性好,并节省80％以上的硝酸银用量;对检测细胞膜蛋白的灵敏度,远高于考马斯亮蓝染色法。     

用光敏生物素标记的DNA探针进行染色体原位杂交(论著摘要)

核酸原位杂交技术是使用碱基序列已知、带有放射性或非放射性标记的核酸探针,依据碱基互补配对原理,通过放射自显影或非放射自显影(免疫酶促显色反应及荧光检测等)检测体系,在组织切片、细胞、间期核及染色体上检测待定DNA或RNA序列的一种手段;是一种最直接、简便的研究核酸定性.定位及相对定量的一种方法.以往,这方面的工作基本上依赖同位素标记技木,它虽具有灵敏、分辨率高等优点,但也有不稳定,相对不安全,自显影时间长、废物难以处理及杂交颗粒与染色体不在同一平面和放射     

关于流行性出血热病毒和超微病理的研究

1.流行性出血热病毒结构蛋白与RNA的定位及其形态发生的研究 本研究应用常规电镜技术,抗病毒结构蛋白单克隆抗体(McAb)胶体金标记免疫电镜技术,~3H-uri-dine标记电镜放射自显影,电镜放射自显影与免疫胶体金双标记以及电镜细胞内核酸原位杂交技术,以常规形态学观察与病毒结构蛋白定位、定性相结合,病毒结构蛋白定位与病毒RNA定位相结合,以及三者之     

染色体原位杂交技术研究进展与应用

染色体原位杂交技术是利用放射性或非放射性标记已知的核酸探针,通过放射自显影或酶促显色反应与荧光显示在染色体上检     

桃仁蛋白梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究

电泳作为一种分离蛋白质的手段已是含蛋白中药材鉴定的常用方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE)是利用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合形成的立体网状物作为载体对不同的带电物质进行分离的电泳方法。梯度 PAGE是 PAGE的改进方法 ,可用来将不同大小的蛋白质分开 ,配合标准相对分子质量蛋白可以对待测蛋白质进行相对分子质量测定。从已有的资料来看 ,用于鉴定的电泳方法有平板PAGE[1] ,圆盘 PAGE[2 ] ,SDS- PAGE[3] ,高效毛细管电泳 [4 ] ,同功酶等电聚焦 [5] ,醋酸纤维薄膜电泳 [6]等。到目前为止 ,还未见用梯度 PAGE法进行中药鉴定…     

PCR-SSCP中聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法的探讨

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)是聚合酶链反应 -单链构象多态 (PCR- SSCP)分析中不可缺少的技术 ,多用于单链DNA碱基移位、插入或缺失等基因变异情况的筛查。电泳后的凝胶通常是用同位素标记 -放射自显影、溴化乙锭或银染色法染色处理 ,其中以敏感性高、操作简便、安全无毒的银染法广泛应用于各室验室 ,但在实践中发现各种不同的凝胶电泳法和银染法各有其优缺点 [1 ,2 ] ,在此基础上笔者摸索和总结一种结果明显、条带清楚的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法用于 PCR- SSCP分析 ,使 PCR- SSCP分析结果敏感、可靠 ,可供同道参考。1　材料…     

用不同标记的乙型肝炎病毒DNA探针对肝组织内病毒基因进行原位核酸分子杂交

本文报道采用国产[α-(55)~S]dATP及进口[3~H]dNTP与生物素标记HBV DNA全基因探针进行原位核酸分子杂交,均可获得阳性结果。其中[3~H]dNTP标记探针的敏感性与特异性最佳。对6例慢性乙型肝炎患者肝组织切片进行原位核酸分子杂交,结果与肝组织提取物经Southern吸印转移HBV DNA杂交的阳性率完全一致。原位核酸杂交显影后的银颗粒呈灶性分布于肝细胞内,提示病毒在肝内扩散为细胞——细胞间传播方式进行。对1例有复制型HBV DNA的肝癌组织进行原位核酸分子杂交,发现HBV DNA主要分布在光镜下癌细胞旁肝细胞胞浆中,而癌细胞中未测得HBV DNA,其意义有待更多病例数检测后才能阐明。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

非同位素标记DNA探针的制备(简讯)

核酸分子杂交法广泛用于分子生物学研究,对遗传性疾病的探索、优生检查、法医侦破罪犯等都起到重要作用。在分子杂交中,DNA探针的制备是方法成功的关键。目前常用的是~(32)P或~(35)S标记的探针,但在国内高比活性的底物[α-~(32)P]-dATP或[α-~(35)S]-dATP都难得到,阻碍了分子杂交法的应用。 1981年Langer用dATP-生物素做底物,标记DNA,再与过氧化酶联的抗生物素结合,经酶反应显色检测。1983年Leary用碱性磷酸酶代替过氧化物酶,使检测的灵敏度提高了20～50倍,达到同     

原位杂交组织化学的进展及其应用

原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry,ISHH)是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术,此技术的基本原理是通过已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针(probe),如双链或单链DNA探针、RNA探针、合成寡核苷酸探针,与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统(如放射自显影、组织化学或免疫组织化学)在核酸原有的位置上把它显示出来,进而探测组织细胞内标记探针及其转录产物(mRNA)的定位。自1969年,Gall     

放射自显影在移植器官低温保存研究中的应用

目的：研究外源笥三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）是否能够进入低温保存大鼠肝脏细胞内。方法：采用大鼠肝脏持续低温机器灌流保存模型,利用放射自显影技术判定[α-^32P]ATP是否进入细胞内。结果：灌流液中不加[α-^32P]ATP的A组光镜照片显示大鼠肝细胞内外均未见特异性标记银粒显影,而灌流液中含37MBq[α-^32P]ATP的B组光镜照片显示大鼠肝细胞内可见多个大小不等的[α-^32P]ATP自显影银粒分布,而肝窦及肝小叶中央静脉等血管内则几乎无黑色自显银粒分布。结论：外源性ATP能够进入低温保存大鼠肝细胞内。     

生物素-链霉抗生物素蛋白硷性磷酸酶体系标记检测DNA探针

本室采用近年发展的生物素—链霉抗生物素蛋白体系检测特异互补的核酸序列,先经缺口翻译制备生物素DNA探针,分子杂交后,再与链霉抗生物素蛋白—生物素—硷性磷酸酶复合物反应和显色,检测限度约50pg靶DNA,并将其结果与~(35)S标记相同的探针进行了比较。     

高灵敏度荧光染料SYBR的性质及应用

随着聚合酶链反应(PCR)仪的大量普及,PCR产物检测成为临床实验室和科研试验的常规过程。这些产物一般是通过电泳(琼脂糖凝胶电泳或PAGE)后再进行DNA和(或)RNA染色来判断,但传统的核酸染料存在一些不可克服的缺点,如溴乙啶(EB)具强致癌性、硝酸银(AgNO3)染色过程复杂繁琐等。SYBR系列荧光染料1995年由Molecular probes公司推     

神经元胰岛素信号转导磷酸化蛋白质组的初步分析

目的:采用同位素标记、双向电泳、放射自显影结合生物信息学技术对胰岛素(insulin,Ins)在神经元中信号转导的磷酸化蛋白质组进行分析,从蛋白质磷酸化修饰的角度深入探讨Ins在神经元中的信号转导。方法:取新生乳小鼠脑组织,进行神经元原代培养7天,用32P-NaH2PO4标记,分别加入胰岛素和培养基,分别作用0、5、20、60、120min后提取神经元蛋白。进行双向电泳,放射自显影。通过采用PDQuest2D分析软件进行图象分析,并在Swiss-Prot蛋白质数据库和PPDB磷蛋白数据库中查询,对小鼠神经元Ins信号转导磷酸化蛋白质组进行初步分析。结果:①放射双向电泳自显影图谱显示:刺激后60min、120min蛋白质磷酸化状态发生明显改变。②采用PDQuest2D分析软件对图谱差异分析及SWISSPROT蛋白质数据库和PPDB磷蛋白数据库进行查询,提示Ins在神经元的信号传递涉及到多种不同的信号途径和效应分子。结论:采用同位素标记、双向电泳、放射自显影结合生物信息技术可对Ins刺激神经元中的蛋白质可逆磷酸化修饰进行较为全面、动态的分析,寻找出相应的差异蛋白,并可进行初步的定性分析。     

地龙类药用动物的简单序列重复区间分子鉴定研究

[目的]探索利用简单序列重复区间(ISSR)分子标记方法在核酸分子水平上鉴别不同来源的地龙类药用动物.[方法]从100条ISSR引物中筛选出能扩增明显多态性条带的引物,对采集自广东、福建、湖北、上海等地的7个不同品种的地龙类药用动物样品进行扩增和凝胶电泳分析,寻找特征位点.采用NTSYS软件计算材料间的相似系数,并用U...     

透明质酸软骨链蛋白探针对肺肿瘤小鼠放疗靶区勾画的可行性分析

目的提取牛鼻HA软骨链蛋白(HA-CLP),确定其对化学致癌小鼠模型肿瘤边界的指示情况,为肺肿瘤影像学感兴趣区(ROI)边界的勾画提供实验依据。方法建立化学致癌小鼠肺肿瘤模型,用亲和层析法从牛鼻软骨分离纯化HA-CLP,后以125I标记HA-CLP行放射性自显影显像研究,并对肺肿瘤行免疫组织化学分析及蛋白免疫印迹分析。结果实验收获HA-CLP(241.8±63.4)mg(n=5),抽提蛋白率为2.42%;肺肿瘤放射性自显影在2 h显像最清晰;免疫组织化学在2 h能最清晰区分肿瘤边界,其HA-CLP免疫信号最强;肿瘤HA-CLP蛋白免疫印迹均在2 h条带显示最清晰。结论自提物HA-CLP具HABP家族免疫原性,通过应用自提物HA-CLP放射自显影实验以及组织免疫组织化学提示HA-CLP对肺肿瘤边界有良好的指示作用。     

免疫组化联合放射自显影术观察骨髓间充质干细胞在肌营养不良鼠表达抗肌萎缩蛋白*

目的：用免疫组化联合放射自显影术观察移植骨髓间充质干细胞表达dystrophin蛋白情况。方法：用3H-TdR标记的骨髓间充质干细胞经静脉移植肌营养不良鼠（mdx）,在1、2、3、4月取小鼠腓肠肌肉,先进行免疫组化染色,再将标本立即进行放射自显影,3月后再将组织HE染色,显微镜下观察干细胞是否表达了dystrophin蛋白。同时用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察BrdU标记的间充质干细胞移植mdx鼠后的dystrophin蛋白表达为比较标准。结果：两法均观察到移植的干细胞表达了dystrophin蛋白,且观察到的阳性细胞数比较无统计学意义;干细胞表达dystrophin蛋白随着时间有逐渐增高趋势。结论：免疫组化联合放射自显影技术可以用于对干细胞移植后蛋白表达的示踪观察,干细胞移植对肌营养不良具有治疗前景。     

免疫组织化学显色中三种显色方法的比较

自从免疫组织化学方法应用于科研中以来 ,有许多不同的显示抗原的方法 ,直接用荧光标记抗体 ,在荧光显微镜下观察[1] ;用酶标记抗体加显色底物显色 ,光学显微镜下观察[2 ] 。通过这些方法可达到对组织或细胞内多种物质成分进行定性、定位和定量分析的目的 ,但较常用的方法是酶加底物显色即亲和酶免疫组织化学方法。许多学者为了各自的目的选用不同的显色剂 ,使最终产物形成不同的颜色 ,如 :氮蓝四唑 / 5 溴 4氯 3 吲哚基磷酸酯 (NBT/BCIP)为蓝紫色 ,二氨基联苯胺 (DAB)为棕褐色等 ,其中以DAB应用为多。但DAB的敏感性不是很高 ,对此…     

酶标记核酸探针的应用前景

基因探针已逐渐运用于传染病的诊断、流行病学调查、肿瘤学研究、食品检验、人类各种遗传病诊断等。目前使用的基因探针有同位素标记探针和生物标记探针。同位素探针多半使用高度活性放射性同位素标记的多核苷酸探针,以及放射自显影的检测方法,其灵敏度为0.5～5pg的靶DNA;但由于同位素半衰期短、易扩散、操作者个人安全和同位素废物处理等问题,以及检测时间长,不适于临床检测和基层推广使用。而生物素标记核酸探针虽有着放射性物质标记探针可不相比的优点,但生物素标记的核酸探针不论长短,在实际应用中     

秋冬季部分婴幼儿病毒性肠炎病原及临床研究

<正> 材料与方法一、对象为1984～1985年长春市秋冬季婴幼儿病毒性肠炎患者粪便,1986年长春、四平、延边、通化、吉林等5个地区的秋冬季婴幼儿病毒性肠炎患儿粪便。二、将1984～1985年粪便标本做 ELISA检测,全部标本均经电镜(JEM—7)检出有关病毒。对单纯由人轮状病毒(HRV)感染的标本进行核酸(RNA)聚丙烯酰胺电泳(PAGE)分析,确定年度流行优势株。三、ELISA 检测:采用 HRP 标记豚鼠抗HRV—IgG 双抗体夹心法。四、HRV—RNA—PAGE:参照 Hirring法,并做了一些改进。五、以同期未检出病毒的肠炎患儿做为对照组。结论一、病原种类:本文200例经 EMELISA