志贺菌耐多药相关基因水平转移研究

目的 验证志贺菌耐多药相关基因水平转移及对该基因的位置进行初步判定.方法 培养已筛选出的包含耐多药差异基因片段阳性克隆,提取其质粒,PCR扩增其耐多药差异基因片段、纯化、制备探针,与志贺菌敏感株Z23、耐多药大肠埃希菌E.667、转移株的基因组DNA、质粒进行斑点杂交.结果 该耐多药差异基因片段制备的探针与耐多药大肠埃希菌、敏感株、转移株的基因组DNA、质粒进行杂交后,转移株、耐多药大肠埃希菌的全基因组及质粒均有杂交信号,与Z23的全基因组、质粒均没有杂交信号.结论 此耐多药相关基因片段在液体结合实验中由耐多药大肠埃希菌水平转移给志贺菌敏感株,根据斑点杂交结果可判断其存在于耐多药大肠埃希菌和转移株的质粒中.     

志贺菌临床分离株耐多药与调控基因突变关系

目的 研究志贺菌的耐多药性及其耐多药调控基因acrR、marOR的变异性.方法 对56株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星等5种药物的药敏试验,对其acrR、marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,TaqI限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析.结果 筛选出35株耐多药株与11株敏感野生株.56株临床分离的志贺菌属细菌的耐多药率为62.5%;35株耐多药株与11株敏感野生株均扩增出acrR、marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析发现,acrR基因突变率为6.52%,marOR基因突变率为10.87%,11株敏感野生株均未检出以上2种基因突变.结论 志贺菌耐多药率较高,acrR、marOR基因突变可能是其耐多药的调控机制之一.     

志贺菌敏感株诱导耐药与marOR基因突变关系

目的对志贺菌敏感株进行诱导使其耐多药,研究其诱导耐药前后marOR基因的差异。方法用4类抗生素的次抑菌浓度对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验。对志贺菌敏感株及诱导耐多药株的marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,测序比较其诱导耐药前后marOR基因序列的差异。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株,命名为YD株;其最小抑菌浓度(MIC)分别为初始菌株的6～8倍;该诱导耐药株对庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲基异恶唑、头孢噻吩等均耐药;测序结果发现诱导耐药株marOR基因YD株有6个位点出现突变,其中5个为同义突变,1个为错义突变(1630位点A→G,赖氨酸→精氨酸)。结论 marOR基因的突变可能是志贺菌诱导耐药的调控机制之一。     

志贺菌敏感株与基因转移耐多药株蛋白组学分析

目的 对志贺菌敏感株与基因转移耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组比较,寻找细菌耐多药相关蛋白.方法 采用接合基因转移实验对临床分离鉴定志贺菌敏感株进行基因转移耐多药试验;并对志贺菌敏感株及基因转移耐多药株全菌蛋白进行双向电泳;电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析,并对差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MOLDITOF-TOF)分析.结果 成功获得志贺菌基因转移耐多药株,在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分析别检出(946±37)和(1 013±157)个蛋白质斑点;经分析共发现43个差异表达的蛋白点,初步对其中7个差异表达蛋白进行质谱鉴定,基因转移耐多药株中发现2个新出现的耐多药相关蛋白分别为成簇插入的DNA重复序列(CRISPR)相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7);ATP结合盒(ABC)转运蛋白、胱氨酸合成酶、预测的胞浆脂蛋白表达量上调;翻译延长因子Tu及DNA单链结合蛋白表达量下降.结论 对7个耐多药相关蛋白鉴定分析表明,供体菌中一些耐多药相关基因通过基因转移方式插入志贺菌敏感株中并大量表达,同时一些在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调,ABC转运蛋白在志贺菌基因转移耐多药机制中也起重要作用.     

志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析

目的对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用ImageMaster2DPlatinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDITOF-TOF质谱）分析。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±37）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。     

志贺菌毒力相关基因的PCR检测分析

目的：利用PCR方法对武汉地区近年来收集的17株志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况。方法：采用8对引物set1A、set1B、shet2A、shet2B、ial、ipaH、stx1与virA分别对志贺菌中毒力相关基因进行检测,结合常规鉴定方法对PCR扩增结果进行分析。结果：SHET1仅在福氏志贺菌（福氏Ⅱ型、福氏Ⅳ型）分离株（包括其标准株）中存在;SH-ET2存在于各型志贺菌（包括其标准株）;ipaH基因存在于各种类型志贺菌（包括其标准株）;17株志贺菌中,引物shet2A和引物shet2B用于检测sen基因分别检出16株和13株;ial、virA在反复复苏的菌株中检出率有所下降,stx1基因只在痢疾志贺菌中检出。结论：志贺菌快速诊断方法（PCR）中应首选检测志贺菌相关毒力基因ipaH基因。     

志贺菌外排泵cmr基因克隆及耐药作用

目的研究志贺菌外排泵cmr基因的耐药作用。方法以志贺菌临床多耐药株H24基因组为模板，扩增出含cmr基因的1620bp DNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到大肠埃希菌DH5α中，酶切鉴定阳性克隆，对其进行序列测定并用琼脂平皿二倍稀释法对重组菌株进行药敏测试和泵抑制剂实验。结果含有志贺菌cmr基因的大肠埃希菌较不含有该大肠埃希菌对红霉素和四环素的耐药性提高1倍，并且这种耐药性提高可被质子泵抑制剂氰氯苯腙（CCCP）所抑制。结论cmr基因与志贺菌耐药株H24对红霉素和四环素的耐药性相关。     

河北省鼠疫耶尔森菌多位点串联重复序列分析

目的对分离自河北省长爪沙鼠鼠疫疫源地的116株鼠疫菌株进行基因分析研究。方法根据鼠疫基因组比对,选择15对引物对测试菌株进行PCR扩增,并对扩增结果进行分析。结果 15对引物对116株实验菌株均得到相应的扩增结果,同一引物测试菌株扩增结果目标条带长度均一致,串联重复序列的重复数相同。不同引物扩增目标条带长度不同,串联重复序列的重复数也不同,如引物M52对所有菌株扩增产物长度均为153 bp,串联重复序列的重复数均为3,而引物M59的扩增产物长度为250 bp,重复数均为7。结论多位点串联重复序列分析(MLVA)证实河北省鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因稳定,鼠疫菌MLVA数据库将对未来的鼠疫菌变异和溯源提供技术支持。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E快速分型检测

目的建立能在同一PCR反应条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE的PCR快速检测方法,以用于金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断。方法根据Gen Bank公布的SEA、SEB、SEC、SEE基因的保守序列,利用Vector NTI suite 8软件设计SEA/SEE、SEB/SEC通用PCR引物来特异性扩增相应的基因片段,通过优化反应条件,建立在同一PCR反应条件下同时检测SEs各型的PCR检测方法,同时进行常见食源性致病菌的特异性分析及灵敏度分析,扩增产物进行测序鉴定。结果金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEE引物扩增后电泳片段位于目的片段330 bp处,SEB、SEC片段位于目的片段258 bp处,SEA、SEB、SEC和SEE基因PCR产物的电泳片段位于目的片段的579、602、601和125 bp处,结果均显示引物扩增和PCR扩增产物均有预期大小的目的 DNA片段。本方法中的基因引物的PCR扩增金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌O157:H 7、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌均未出现预期大小的目的条带。本方法敏感性达80~100 CFU/m L。结论本检测方法所建立的PCR可用于金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E型别食物中毒的快速诊断和分型检测。     

志贺菌属非典型1类整合子与耐多药关系

目的研究志贺菌属中非典型1类整合子的分布及其与耐多药性的关系。方法对实验室保存的90株志贺菌属进行8种抗生素药敏实验,针对非典型1类整合子的耐药基因盒区域设计引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,对代表性菌株进行测序分析。结果 90株志贺菌属中有86株(95.6%)对≥3种抗生素耐药;有66株(73.3%)对氨苄青霉素(AMP)、四环素(TET)和氯霉素(CHL)联合耐药;非典型1类整合子分布于65株(72.2%)志贺菌属中;RFLP分析结果表明,所有酶切产物的带型均一,测序分析发现序列为blaoxa-30-aadA1;非典型1类整合子阳性菌株对AMP-TET-CHL联合耐药率(81.5%)高于阴性菌株(52.0%),经双侧χ2检验发现差异有统计学意义(P<0.05)。结论志贺菌属非典型1类整合子阳性与其对AMP-TET-CHL联合耐药有关,可能参与耐多药性的形成。     

念珠菌耐药相关基因研究

目的研究耐氟康唑热带念珠菌临床株Fc 30的基因突变耐药机制。方法对氟康唑靶酶基因erg 11进行PCR扩增,DNA测序,对比分析临床耐药株与敏感株及标准株的靶酶基因DNA序列,确定耐药株基因一级结构上的突变点,并推测分析靶酶蛋白的氨基酸改变及与氟康唑耐药的相关性。结果氟康唑敏感株Fc 17的erg 11基因DNA序列与氟康唑敏感标准菌ATCC750完全一致,耐药株Fc 30出现 225、 264、 395、 461、 513处点突变,导致132、154位氨基酸突变。结论与敏感株相比,耐氟康唑热带念珠菌Fc30 erg11基因出现Y132F耐药相关突变。     

吴江地区多重耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因携带情况及同源性

目的了解吴江地区临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)碳青霉烯酶基因携带情况和同源性。方法收集吴江地区3所综合性医院2010年1月—2013年12月临床分离的非重复MDRAB 44株,测定其最低抑菌浓度(MIC);采用聚合酶链反应（PCR）扩增碳青霉烯酶基因OXA 51、OXA 23、OXA 24、OXA 58、IMP、TEM、SHV和GES,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果44株MDRAB主要来源标本为痰（占93.18%）,主要分布在重症监护病房（ICU）、呼吸科和神经外科,各占45.45%、27.27%和13.64%;MDRAB对米诺环素和多粘菌素B均敏感,对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星耐药率均为100.00%,对亚胺培南和美罗培南耐药率均为97.73%。44株MDRAB均检出OXA 51、OXA 23和TEM基因,其中12株菌GES基因阳性,OXA 58和SHV基因阳性各1株,未检测到OXA 24及IMP基因;MDRAB分为A—G 7个型别,分别为19、3、9、3、1、4、5株。A型主要来源于吴江地区的两所大型综合性医院（吴江第一人民医院和盛泽医院）,吴江第一人民医院未发现B、D和E型;E型仅1株,分布在永鼎医院,其余型别散在分布。结论吴江地区临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药严重,基因OXA 23和TEM是鲍曼不动杆菌多重耐药的主要原因,并以A、C型为主,呈克隆性传播。     

某院结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征

目的了解某院结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpo B及异烟肼耐药相关基因kat G、inh A的突变特征,为耐药结核病的预防和治疗提供科学依据。方法收集83例结核病患者痰标本,分离培养MTB,采用BD960液体法检测利福平、异烟肼耐药性,提取菌株DNA,采用聚合酶链反应扩增rpo B、kat G、inh A全基因,对扩增产物进行测序分析。结果 83株样本中,39株对利福平耐药,51株对异烟肼耐药。耐利福平菌株rpo B基因突变率为97.44%(38/39),531位点突变率60.53%(23/38),526位点突变率23.68%(9/38),32株出现多位点联合突变。耐异烟肼菌株kat G基因突变率为98.04%(50/51),共发现16种突变类型,其中以kat G 315位点突变为主,占70.00%(35/50),1株为kat G与inh A联合突变。结论该院耐多药MTB产生耐药性与rpo B和kat G基因突变相关,检测MTB耐多药相关基因突变可为早期快速诊断耐药结核病提供参考依据。     

呼吸ICU耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药基因的携带情况及同源性

目的了解我院呼吸ICU耐碳青酶烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)携带的β-内酰胺酶的耐药基因及其流行特征。方法收集2015年10—12月呼吸ICU临床患者送检标本分离的CRAB。试验菌株进行5种耐药基因(KPC-2、IMP、VIM、NDM-1、OXA-23)PCR特异性扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序分析,并且进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)同源性分析。结果 2015年10—12月呼吸ICU共分离CRAB22株,其中19株(86.36%)分离于痰。22株CRAB对复方磺胺甲口恶唑的耐药率为59.09%,对米诺环素的耐药率为9.09%,对多粘菌素B均敏感,对其他检测抗菌药物的耐药率均为80%以上。PCR扩增未检出KPC-2、IMP、NDM-1三种耐药基因,而VIM、OXA-23阳性率均为100%。PFGE同源性分析结果:22株菌分为13种不同带型,每种带型包含菌株数为1~5株不等,其中9种带型(69.23%)分别只包含1株菌,其他4种(30.77%)带型包含菌株数为2~5株不等。其中,A5、A7和A8为同一型,A9、A11、A14、A19和A22为同一型,A4、A10和A12为同一型,A16和A18为同一型。结论呼吸ICU分离CRAB携带的β-内酰胺酶耐药基因主要为VIM、OXA-23型基因。同源性分析证实,有小部分为同一克隆株,存在小范围的流行。     

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。     

全基因测序分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌利奈唑胺耐药相关变异位点

目的通过全基因组测序研究利奈唑胺(LZD)敏感株和诱导耐药耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)之间基因变异位点差异,了解LZD耐药基因变异位点。方法采用不同浓度梯度的LZD对遗传背景清晰的MRSA-MS4母株进行诱导,获得LZD耐药菌株MRSA-MS4-LZD100,测定最低抑菌浓度(MIC),采用普通聚合酶链反应(PCR)扩增MRSA-MS4-LZD100 23S rRNA V区及核糖体蛋白L3/L4基因,测序后与野生株比较,获得相应的突变位点;采用Illumina HiSeq 2000测序技术对样品DNA进行paired-end(PE)测序,构建Illumina PE文库,利用生物信息学完成该菌株的全基因组测序。结果经过32代诱导,获得MRSA-MS4-LZD100菌株,其LZD MIC为96μg/mL。PCR测序分析提示其V区多拷贝基因均存在G2447T突变,L3蛋白存在Gly113Val突变;全基因组包含2 744 315 bp碱基对,注释后共有2 509个基因,11个tRNA编码基因,以及2个完整的rRNA基因编码操纵子,获得PubMed全基因序列号(JXMJ00000000);共找出101个SNP和6个Small indel突变,发生于外显子的SNP占16个,SNP后导致氨基酸序列改变的蛋白质包括IstB ATP结合区域包含蛋白、凝集因子A及转座子IS1272等,而发生于外显子的Small indel占3个,Small indel突变后导致氨基酸序列改变的蛋白质包括假设蛋白、30S核糖体蛋白S1、凝集因子A。结论经LZD诱导获得LZD耐药MRSA-MS4-LZD100菌株,测序分析提示该菌株存在除23S rRNA V区及L3蛋白基因以外的突变位点,为进一步研究隐性LZD耐药机制指明了方向。     

利福霉素耐药结核分枝杆菌rpoB突变与利福布丁耐药水平的关系

目的研究利福霉素耐药结核分枝杆菌 rpoB基因突变与利福布丁耐药水平的相关性。方法倍比稀释法测定64株利福霉素耐药及6株敏感菌株对利福布丁的最低抑菌浓度(MIC),并分析其对异烟肼的耐药情况。同时对rpoB全基因扩增后测序,分析rpoB突变位点和突变性质与利福布丁MICs高低及多重耐药的关系。结果6株敏感株rpoB未突变,MICs为 0.25～0.50 mg/L。64株耐药株rpoB突变率为100％。37株利福布丁高度耐药(MICs≥4 mg/L)株中,S531L突变27株,H526R突变和Y389C突变各2株,S531W、H526Y、Q513K、V176F、D516Y联合Q253R突变与D516G联合L511P突变各1株。17株中度耐药 (MICs 2～4 mg/L) 株中,S531L突变16株,D516G联合L511P和S509R突变1株。10株低度耐药（MICs 0.25～1 mg/L）株中,L533P、H526L、H526S、D516V、D516Y单点突变各2株。93.75％(60/64)的利福霉素耐药株对异烟肼耐药。结论检测rpoB突变即可初步筛选多重耐药结核分枝杆菌;中、高水平利福布丁耐药株以S531L突变占绝对优势,rpoB突变位点及突变类型与利福布丁耐药水平有一定相关性。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的分子流行特征分析

目的 研究不同医院分离的鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶的基因型和分子流行特征.方法 采用琼脂稀释法检测64株多重耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC);PCR检测碳青霉烯酶基因、整合酶基因及per基因,选取不同的耐药克隆菌株进行序列测定;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源关系,确定菌株的分子流行特征.结果 50株菌(78.1%)携带blaOXA-23-like基因,经测序分析确定为OXA-23;1株菌检测出blaOXA-58-like基因;57株菌(89.1%)携带I类整合子;25株菌(39.1%)检测出blaPER-1基因.PFGE图谱显示64株菌分为A、B、C、D、E等13个基因型,三家医院分别以A型、B型和U型为主要流行株.结论 三家医院均发现多耐药鲍曼不动杆菌的播散流行,不同医院间和同一医院不同科室间存在同型别流行;三家医院多耐药鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶常携带OXA-23型酶,同时检测出blaOXA-58、I类整合子和balPER基因.     

江苏省2012-2014年柯萨奇病毒A组16型分子流行病学特征分析

目的 了解江苏省2012-2014年柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）流行毒株基因型概况。方法 收集江苏省2012-2014年儿童手足口病标本并送样,进行病毒分离培养获取相应毒株,用CA16特异性引物通过反转录聚合酶链反应技术进行VP1区基因片段扩增和测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,并与CA16参比株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果 分离得到82株CA16毒株,测序结果显示全部属于基因亚型B1,VP1基因分析显示其中9株毒株序列的基因亚型为B1a,另外73株毒株序列的基因亚型为B1b。CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为87.8%～100.0%和97.5%～100.0%;与CA16国际标准株G10核苷酸和氨基酸同源性分别为75.2%～78.2%和90.5%～91.9%。结论 江苏省2012-2014年分离获得CA16毒株属于基因亚型B1,以B1a和B1b两个分支共同进化和流行,其中又以B1b为优势亚型。