定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植中的应用

巨细胞病毒 (CMV)感染是肾移植受者发病和死亡的重要原因。本文就定量PCR在预测肾移植受者CMV感染的症状发作期及监测更昔洛韦的疗效等方面的价值进行阐述。     

定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植中的应用

巨细胞病毒（CMV）感染是肾移植受者发病和死亡的重要原因。本文就定量PCR在预测肾移植受者CMV感染的症状发作期及监测更昔洛韦的疗效等方面的价值进行阐述。     

实时荧光PCR检测人巨细胞病毒糖蛋白H基因分型

目的利用实时荧光PCR技术建立一种快速、灵敏而特异的检测巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白H基因(gH)分型的方法。方法针对HCMV gH基因的保守区域和分型区域,设计一对保守引物及其相应gH分型的Taq Man探针。实时荧光PCR技术检测HCMV标准株AD169(gH1型)与TOWNE(gH2型),进行特异性及灵敏度评价。另对112例确诊HCMV感染患儿的尿液标本DNA进行检测,再随机选取gH1、gH2基因型PCR扩增阳性产物各4例进行测序验证。结果建立的实时荧光PCR可以特异识别HCMV标准株的gH分型,且检测灵敏度达102CFU/m L。112例尿液标本中86例为gH1型HCMV感染,25例gH2型HCMV感染,1例为HCMV gH基因两种型别混合感染。8株临床分离样本测序结果显示,gH基因和标准株相比保守性95%。结论本研究建立的实时荧光PCR方法快速、特异,适用于HCMV gH基因分型的临床检测。     

实时荧光定量PCR反应检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16/18型和巨细胞病毒的协同感染

目的探讨宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16/18型和巨细胞病毒协同感染的关系。方法采用实时荧光定量PCR反应(FQ-PCR)同时检测两种病毒的感染率。结果38例宫颈癌中检出HPV16/18型35例(阳性率92.11%),CMV11例(阳性率28.95%)。32例宫颈癌前病变(CIN)中检出HPV16/18型20例(阳性率62.50%),CMV7例(阳性率21.87%)。30例正常宫颈脱落细胞中检出HPV16/18型5例(阳性率16.67%),未检出CMV。结论宫颈脱落细胞HPV16/18型感染率随宫颈病变程度的加重而升高,且差异有显著性(P<0.05),CMV感染率随宫颈病变程度的加重而升高但差异无显著性(P>0.05),CMV仅是协同HPV16/18型感染导致宫颈癌的发生。     

实时定量聚合酶链反应检测巨细胞病毒在同种异基因造血干细胞移植术后监测中的意义

目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法对CMVDNA进行定量检测。结果:移植后100d内,52例患者中28例检测到CMVDNA复制。造血干细胞移植(HSCT)供者类型和移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)的发生与CMV激活明显相关(P值分别为0.018和0.039)。在44例可评估患者中,allo-HSCT100d后仅7例检测到CMVDNA复制,其发生率与移植后发生GVHD且接受激素治疗(P=0.0009)、人类白细胞抗原(HLA)全相合无关供者移植或者HLA部分相合同胞供者移植有关(P=0.037)。应用实时定量PCR检测发现,CMV对更昔洛韦抢先治疗的应答存在2种动力学模式(快速型和缓慢型),其中表现为缓慢型的患者CMV最高负载量较快速型高10倍以上,其病毒衰减时间也要延长3～4周,多数发生在因出现GVHD而接受激素治疗以及接受HLA全相合无关供者和HLA部分相合同胞供者干细胞移植的患者。结论:移植前CMV血清型阳性患者接受allo-HSCT后100d内出现CMV激活是常见并发症。移植100d之后,对于未发生GVHD而未使用激素治疗者或以HLA全相合同胞为供体的患者,CMV激活概率低,无需进行常规频繁监测。     

巨细胞病毒定量PCR与pp65抗原测定监测异基因造血干细胞移植巨细胞病毒感染的比较

本研究比较巨细胞病毒（CMV）定量PCR检测和CMV—pp65抗原检测在异基因造血干细胞移植CMV感染中的诊断价值。以84例异基因造血干细胞移植患者为研究对象,自预处理开始每周对患者EDTA抗凝外周血血标本进行CMV—pp65抗原及cMV定量PCR动态检测,直至出院,比较观察两者在诊断CMV感染中的作用。结果表明：84例移植患者的732份系列血标本中,26例移植后检出CMV定量PCR阳性,检出率30．95％,其中9例为cMV血症,13例为cMV病,检出中位时间为37．1（7—105）天;22例CMVpp65抗原检测阳性,检出率26．19％,检出中位时间为46．6（10—128）天;所有CMV—pp65抗原检测阳性患者CMV定量PCR均为阳性,4例CMV定量PCR阳性但CMV—pp65抗原检测阴性患者均未发展为CMV病。CMV病多出现于CMV定量PCR中等至高拷贝数或中等至高水平病毒血症（CMV—pp65抗原）病例中。治疗后CMV定量PCR转阴中位时间为17．5（11—28）天。CMV—pp65抗原转阴中位时间为10．0（7—21）天。结论：CMV定量PCR和CMV—pv65抗原检测均能作为异基因造血干细胞移植CMV感染早期诊断的有效手段,CMV定量PCR更敏感,CMV—pp65抗原检测更特异,两者同时使用能更有效地提高CMV感染诊断水平,监控其发生发展。     

尿巨细胞病毒-DNA载量与血清巨细胞病毒-IgM检测在新生儿巨细胞感染中的价值

目的 以实时荧光定量PCR法（FQ-PCR）检测尿液中巨细胞病毒载量,以化学发光法检测血清中CMV-IgM,探讨两种方法 联合应用在新生儿巨细胞病毒（CMV）感染中的临床价值.方法 144例疑似CMV感染新生儿的血清用化学发光检测CMV-IgM,尿液用FQ-PCR检测CMV-DNA载量,比较抗病毒治疗前、后两种检测结果 的变化.结果 两种方法 单独检测的阳性率分别为55.56%和66.67%,两者比较,差异无统计学意义（χ2=3.20,P＞0.05）,两种方法 联合检测的阳性符合率为76.39%（110/144）,明显高于两方法 单独检测阳性率,差异均有统计学意义（χ2分别=4.47、5.21,P均＜0.05）.抗病毒治疗后血CMV-IgM和尿CMV-DNA两种检测结果 均较治疗前明显下降,差异均有统计学意义（t分别=7.45、9.31,P均＜0.05）.结论 尿液CMV-DNA病毒载量与化学发光法血清CMV-IgM联合检测,可以明显提高新生儿巨细胞病毒感染检测的阳性率.     

实时荧光定量PCR技术在肾移植术后巨细胞病毒性肺炎诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植术后肺部感染诊断中的应用价值。方法应用实时荧光定量PCR检测2002年1月至2006年1月在本院行肾移植术后肺部感染患者39例,健康自愿者50人的血清CMV DNA载量,应用SPSS10 0软件对检测结果进行统计学分析。结果肺部感染患者组39份样本中,19份可以检测到数值(阳性率为49%),其病毒拷贝数值介于1.05×103~4.26×105之间,平均为2.23×104;对照组中仅一份检测到数值(阳性率为2%),且CMV DNA小于104,其余49份均低于检测下限,实时荧光定量PCR检测CMV结果对病情发展有预测价值。结论实时荧光定量PCR技术为肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的早期诊断提供了有效的试验手段,从而大大提高了肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的治愈率。     

乙型肝炎病毒核酸的实时荧光定量PCR检测及其临床意义

目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P<0.01),病毒平均含量为7.52±0.43 cop ies/m l;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0.01),但平均病毒含量与大三阳组无差异(P>0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。     

套式PCR检测尿液中的人类巨细胞病毒DNA

用套式ＰＣＲ方法检测ＨＣＭＶ，并与一次ＰＣＲ进行比较。同时对两种尿样品ＤＮＡ提取方法进行了初步探讨，以期在临床检验中减少假阴性，提高ＨＣＭＶ的检出率和准确率。１材料与方法１．１材料ＨＣＭＶＡＤ－１６９株由解放军３０２医院病毒室提供。引物位于ＨＣＭＶＩ...     

Quantitative PCR determination of human cytomegalovirus in blood cells

We evaluated a rapid and sensitive method to determine human cytomegalovirus (CMV) DNA levels in blood cells using a quantitative polymerase chain reaction (PCR) technique. This method is based on real-time detection of PCR using a dual fluorescence-labeled probe and a sequence detector. Ten copies of CMV DNA were detected, when 1 microg of DNA from blood samples was used with this method, and a good correlation was obtained between increased concentrations of copy numbers calculated and measured copy numbers of CMV DNA (r = 0.999). Forty normal subjects exhibited no copies of CMV DNA. On the other hand, a 6-month-old girl tested positive for increased levels 4 weeks after liver transplant. This method is simple, accurate, and sensitive for the quantitative detection of CMV DNA in vivo, indicating possible applications for the diagnosis and monitoring of CMV infection.     

实时定量PCR检测血液恶性肿瘤的微小残留病

实时定量PCR(RQ-PCR)是近年出现的一种新的核酸定量技术,将常规PCR与探针杂交技术融为一体.在PCR反应体系中加入荧光探针,该探针与靶DNA/cDNA特异性结合.PCR反应延伸阶段,Taq酶发挥其5'→3'外切酶活性将荧光探针切断,荧光信号得以释放,荧光信号强度与PCR产物成正比.因此,通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,可以在一个密闭体系中对待测标本进行精确定量分析.RQ-PCR成功地解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染而导致假阳性、需进行PCR后处理等问题,为检测血液系肿瘤微小残留病提供了快速、简便、精确、敏感、可靠的工具.本文阐述了RQ-PCR的基本原理以及在血液系统恶性肿瘤,如急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和恶性淋巴瘤微小残留病检测中的应用.     

母乳及婴儿血液、尿液人巨细胞病毒DNA检测在婴儿HCMV感染中的应用

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测巨细胞病毒（HCMV）DNA在诊断孕妇及婴幼儿感染的价值。方法采用FQ-PCR技术检测106例母乳喂养的疑似HCMV感染患儿尿液、血液、配对母乳中HMCV-DNA的水平。结果患儿尿液、血液阳性率分别为57.55%、44.34%,两者比较有显著差异（P〈0.05）。尿检阳性患儿配对母乳的阳性率为88.5%,尿检阴性患儿配对母乳的阳性率为31.1%,两者比较差异有统计学意义（P〈0.05）。血检患儿阳性的配对母乳阳性率为76.6%,血检阴性患儿配对母乳阳性率为54.2%,两者比较具有显著差异（P〈0.05）。结论 HCMV感染母乳可能是婴儿感染HCMV的主要途径之一[1],FQ-PCR的推广应用对快速检测HCMV感染有着重要意义。     

实时荧光定量PCR检测人粪便中空肠弯曲杆菌方法的建立与评价

目的：建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y＝-3.51 Log（X）＋37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4％,95.8％和94％;检测结果重复性良好（CV％＜5％）。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强（Kappa＝0.88,P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。     

人巨细胞病毒体外感染诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡

本研究探讨人巨细胞病毒（hCMV）体外感染是否可引起早幼粒细胞的增殖、分化抑制、诱导其凋亡，并探讨其作用机制。采用hCMV AD169株体外感染早幼粒细胞白血病细胞HL-60，用PCR检测hCMV DNA，用形态学观察、DNA片段化检测及Annexin V／PI染色流式细胞仪检测等方法分析细胞凋亡情况。结果表明：hCMV AD169株在体外能明显抑制早幼粒细胞白血病细胞HL-60的生长，抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系；PCR检测发现病毒感染组HL-60细胞中有hCMV IEA的表达；形态学观察和DNA片段化检测证实了细胞凋亡的存在；流式细胞仪检测结果显示HL-60细胞凋亡率随培养液中病毒浓度的加大和感染时间的延长而增高，二者呈依赖关系。结论：hCMV AD169株在体外可直接感染HL-60细胞；hCMV AD169株在体外感染HL-60细胞后，可抑制HL-60细胞的分化和增殖；hCMV AD169株体外感染HL-60细胞后可诱导其凋亡，且凋亡率与病毒剂量及作用时间呈依赖性关系。     

用PCR方法检测献血者的HCMV感染情况

我们用PCR方法对某医院110名献血者的HCMV感染情况进行了检测和分析。结果发现,献血者中HCMV-DNA阳性率为61.8％(69/110);同时显示出HCMV-DNA阳性率随年龄增大而增高,由于献血者中存在着HCMV高带毒率的现象,建议在免疫缺陷病人,移植者及婴儿等特殊易感人群输血时,应对献血者的血液进行HCMV的检测和筛选。     

非清髓异基因外周血造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的危险因素分析

本研究旨在探讨非清髓异基因外周血造血干细胞移植（NST）后CMV感染及CMV病的发生特点及其危险因素,为NST后cMV感染的诊断、监测和抢先治疗提供参考。用实时定量聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测了80例在本院血液科行NST患者外周血白细胞巨细胞病毒（CMV）DNA载量,并对其临床资料进行了回顾性分析。结果表明,NST后62／80例发生cMV感染（77．5％）,首次检出CMV—DNA阳性的中位时间为移植后35d（17—133）,经抢先治疗后,移植后100d内CMV病累积发生率为11．3％。单因素分析及多因素分析均显示,预处理方案中使用抗人胸腺细胞免疫球蛋白（ATG）、合并其它疱疹病毒感染（单纯疱疹病毒、EB病毒、水痘-一带状疱疹病毒等）及移植前有真茵感染病史均为CMV感染的危险因素。单因素分析提示,CMV血症及预处理方案中使用ATG是CMV病的危险因素。合并Ⅱ-Ⅳ度aGVHD23例患者CMV感染率为91．3％（21／23）,但与0-I度aGVHD组的CMV感染率71．9％相比,无统计学差异（P=0．06）。多因素分析未发现与CMV病相关的危险因素。结论：预处理过程中使用ATG有可能增加NST后CMV感染和CMV病的发生率,CMV感染容易与其它疱疹病毒感染及真菌感染伴发。移植后亦应当重视对其它疱疹病毒及真菌的监测及预防。     

巢式PCR法检测髓系白血病患者外周血人类疱疹病毒—6的NDA

人类疱疹病毒－６型（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ－６,ＨＨＶ－６）是一种常见的病毒,与多种人类疾病有关。由于研究过程所采取方法不同,对于白血病病人感染ＨＨＶ－６情况的报道也不一致。本研究首次运用巢式ＰＣＲ检测了３８例髓系白血病病人外周血单个核细胞中的ＨＨＶ－６ ＤＮＡ,其中急性髓性白血病（ＡＭＬ）３０例和慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）８例。结果显示：与下沉对照ＨＨＶ－６的ＮＤＡ检出率相比,ＡＭＬ     

婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒感染检测方法的比较

目的：探讨婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒(HCMV)感染的检测方法。方法：用HCMV pp65抗原血症法及荧光定量聚会酶链反应(FQ-PCR)法检测24例患儿34份血浆及多形核白细胞(PMNLs)标本。结果：HCMV pp65抗原血症法诊断巨细胞病毒感染所致婴儿肝炎综合征的特异度为100％，灵敏度为90％；FQ-PCR法检测PNNLs的特异度为100％，灵敏度为60％；血浆FQ-PCR法的特异度为100％，灵敏度为50％。同一份血标本其血浆中的HCMVDNA拷贝数低于PMNLs，使得血浆FQ-PCR法在HCMV诊断及疗效观察方面具有滞后现象。动态观察发现HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法检测的PMNLs结果与婴儿肝炎综合征患儿的治疗过程有较好的符合率。结论：HCMV pp65抗原阳性与HCMV活动性感染密切相关，可作为婴儿肝炎综合征患儿疗效的观察指标。HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法可作为临床诊断HCMV症状性感染的一种快速、有效的实验室方法。     

应用实时荧光PCR分析apoE3、4等位基因

目的 建立实时荧光PCR进行apoE单核苷酸多态性(SNP)分析法,快速检测人栽脂蛋白E(apoE)等位基因.方法 以人apoE基因中的Cys112Arg为研究对象,用荧光染料SYBR Green Ⅰ标记PCR产物,通过熔解曲线分析结果,并进行SNP分型.用高保真DNA聚合酶提高SNP测定的特异性;通过DNA测序验证荧光定量PCR对apoE基因Cys112Arg分型结果的准确性.结果 每个样品设立2个检测管,利用下游引物P2和SNP检测引物P33、P44进行定量PCR反应,30份样品各自获得2种等位基因扩增产物的熔解曲线,通过熔解曲线的Tm值判读,在30份样本中,apoE基因型3/3、3/4分别有27例和3例,与PCR-RFLP及DNA测序结果一致.结论 建立的apoE等位基因分型法操作简便,结果准确,适合人外周血apoE等位基因的定性检测.