腺病毒介导的LacZ基因在大鼠坐骨神经的表达

目的 :观察腺病毒介导的LacZ基因在大鼠坐骨神经雪旺细胞 (Schwanncells ,SCs)的表达。方法 :大鼠坐骨神经内直接注射报告基因LacZ重组腺病毒 (Ad LacZ) ,X gal组织化学染色检测LacZ基因的表达 ,采用LEICAM 5 5 0型图像分析仪对坐骨神经切片X gal染色强弱进行定量评价。结果 :将滴度为 1× 10 8PFU /ml的Ad LacZ病毒液 10 μl注入坐骨神经 2d后即可检测到LacZ的表达 ,7～ 14d表达显著增加 (与 2d组比较P <0 .0 1) ,7d组与 14d组表达量无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 8d时SCs蓝染又减弱 (与 7d组和 14d组比较P <0 .0 1)。注射生理盐水的对照组X gal染色阴性。结论 :腺病毒介导的LacZ基因可转入活体动物坐骨神经内并高效表达 ,表明腺病毒介导神经营养因子等基因治疗有促进周围神经损伤再生的作用。     

腺病毒介导的NT—3基因在大鼠从骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素 - 3(neurotrophin- 3,NT- 3)基因在大鼠坐骨神 经雪旺细胞 ( Schwann cells,SCs) 的表达.方法 NT- 3重组腺病毒在 293细胞中培养繁殖并 测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染 色检测 NT- 3蛋白的表达,并用 LEICA M550型图像分析仪对坐骨神经切片 NT- 3免疫组化染色 强弱进行定量评价.结果坐骨神经损伤修复后直接注射 Ad- NT- 3,2 d后出现 NT- 3免疫组化 染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7 d时显著增加 ( 与 2 d组相比,P< 0.01),14 d和 28 d时有所下降 ( 与 7 d组相比,P< 0.01),两者差异无显著 性意义 ( P >0.05),但与 2 d组相比,仍维持在较高的水平 ( P< 0.01).而正常坐骨神经、 损伤修复后注射 Ad- LacZ或生理盐水的坐骨神经 NT- 3免疫组化染色结果为阴性.结论 NT- 3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的 SCs并表达 NT- 3蛋白,为腺病毒介导神经 营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据.     

腺病毒介导的LacZ基因在培养许旺细胞中的表达

目的 观察腺病毒介导的LacZ基因在培养许旺细胞中的表达。方法 用报告基因LacZ重组腺病毒感染原代培养的许旺细胞，X-gal组织化学染色检测LacZ基因的表达。结果 用LacZ重组腺病毒感染培养的许旺细胞时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率分别为200、100时，24、48h后接近100％的许旺细胞被感染。而且感染后许旺细胞的形态无明显异常，增殖能力也没有受到影响。结论 腺病毒介导的LacZ基因可转入体外培养的许旺细胞并高效表达，同时许旺细胞的生长特性并不受影响，为腺病毒介导神经营养因子等基因治疗促进外周周围神经损伤再生奠定了基础。     

重组腺病毒介导LacZ基因在大鼠肺脏的表达

目的探讨重组腺病毒介导的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因在大鼠肺脏的转基因表达。方法Wistar大鼠70只,随机分为Ad-Null组和Ad-LacZ组(n=35),分别应用1．67×10~9pfu／ml复制缺陷型重组腺病毒AdCMV和AdCMVLacZ各600μl,经气管导管滴入；各组于滴人病毒后2、5、7、14、21、28和35 d行肺组织X-gal染色。另取大鼠20只,随机分为C组、L组、M组和H组(n=5),分别应用病毒保存液和低滴度(1．67×10~8pfu／ml)、中滴度(1．67×10~9pfu／ml)、高滴度(5×10~9pfu／ml)的AdCMVLacZ各600μl,滴入病毒后7 d行肺组织X-gal染色和HE染色。结果滴入病毒后2 d,Ad-LacZ组肺组织内即有转基因表达,滴人后7 d达高峰,并维持至35 d；转基因表达位于气管、支气管上皮细胞和肺泡细胞。H组、M组转基因阳性细胞率明显高于L组和C组(P＜0．01)。HE染色显示,H组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润。所有动物均未见远隔器官转基因表达。结论气管内滴人重组腺病毒可呈剂量依赖性介导LacZ基因在大鼠肺内表达,但过高剂量可诱发机体炎性反应。     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

Expression of adenovirus-mediated neurotrophin-3 gene in Schwann cells of sciatic nerve in rats

Sｕｃｃｅｓｓｆｕｌｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｒｖｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｆｔｅｒｍｉｃｒｏｓｕｒｇｉｃａｌｒｅｐａｉｒｒｅｑｕｉｒｅｓｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｍｉｃｒｏ ｍｉｌｉｅｕ .Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓ(ＮＴＦｓ) ,ｍａｉｎｐａｒｔｓｏｆｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｉｃｒｏ ｍｉｌｉｅｕ ,ｈａｖｅｂｅｅｎｓｈｏｗｎｔｏｐｌａｙａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｒｏｐｈｉｃｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａ…     

腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响

目的 研究腺病毒介导的多种基因在肝癌细胞中的表达和对肝癌细胞生长的影响。方法 构建含人ｐ５３、Ｂ７－１、ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体,感染３种肝细胞癌细胞系和肝细胞系Ｌ０２,运用ＥＬＩＳＡ、免疫组化、流式细胞仪等方法,检测目的基因在肝癌细胞中的表达,和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果 肝癌细胞对腺病毒高度易感,腺病毒多重感剂量为５０（５０ＭＯＩ时）,可使９０％左     

腺病毒介导的BDNF基因在体外嗅鞘细胞中的表达及其生物学活性实验研究

目的：用重组腺病毒载体Ad-BDNF感染体外培养的嗅鞘细胞，从基因转录和蛋白表达水平检测HDNF基因在体外OECs中的表达，对OECs表达的BDNF生物学活性进行观察。方法：提取细胞总RNA进行RT—PCR扩增BDNF、基因，应用ELISA方法检测其培养上清中BDNF含量，并通过与原代脊髓神经元共培养观察BDNF活性。结果：实验证实经BDNF重组腺病毒感染的OECs中有BDNF的转录；其培养上清应用ELISA方法分析，在感染后24h即有EDNF的表达，并可以维持3．5d的高峰表达。与EDNF、重组腺病毒感染的OECs共培养的脊髓神经元可以在无血清条件下存活3—5d。结论：重组腺病毒BDNF、基因可以在OECs中稳定、高效表达，其表达的BDNF具有促进脊髓神经元存活的生物活性.     

重组腺病毒介导的β-神经生长因子基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

[目的]探究携带β-神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒转染大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的最佳感染复数(MOI),并从基因转录和蛋白合成两个水平上观察转染后EPCs对β-NGF基因的表达,探讨其对脊髓损伤后神经元细胞微环境的影响。[方法]密度梯度离心法分离、全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓源EPCs,免疫荧光法检测EPCs特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2的表达。用不同MOI值的携带β-NGF基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组腺病毒转染EPCs,确定最佳的MOI值。用携带β-NGF基因的重组腺病毒转染的细胞为β-NGF基因组,用空载的重组腺病毒转染的细胞为空载组,未转染的细胞为空白组。RT-PCR法、Western blot法和ELISA法检测β-NGF的表达。[结果]成功分离、培养出大鼠骨髓源EPCs,特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2经鉴定呈阳性表达;携带β-NGF基因的重组腺病毒转染EPCs最佳的MOI为70;转染成功的细胞β-NGF基因在m RNA和蛋白两个不同的水平上表达都升高,并持续向细胞外分泌。[结论]携带β-NGF基因的重组腺病毒可成功转染EPCs,成功转染β-NGF基因的细胞能持续向细胞外分泌有活性的β-NGF蛋白。     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK基因诱导人胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对人胃癌细胞靶向治疗的作用。方法用重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染SCG7901细胞和HepG2细胞,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。应用透射电镜、Hoechest 33258/PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。建立小鼠SCG7901细胞动物模型,计算抑瘤率。用TUNEL法检测细胞凋亡率。结果受感染SCG7901细胞和HepG2细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。已转染腺病毒的SCG7901细胞和HepG2细胞的存活率分别为(21.5±3.2)%和(89.1±3.4)%,两种细胞表现出对前药不同的敏感性(t=25.23,P=0.00)。流式细胞术检测表明该体系抑制SCG7901细胞的DNA合成,亚二倍峰数值之间差异有统计学意义(t=8012,P=0.00)。Hoechest 33258/PI染色和电镜下可见SCG7901细胞有凋亡改变。裸鼠移植瘤的肿瘤体积明显缩小。实验组肿瘤细胞凋亡指数为(36±6)%,较对照组显著增加(P=0.00)。结论KDR启动子可以调控融合基因体系在体外选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且诱导体内外人胃癌细胞的凋亡。     

大鼠外周神经损伤后许旺细胞表型改变的初步探讨

目的 探讨用免疫标记方法观察外周神经修复过程中许旺细胞表型改变的意义.方法 用SD雄性大鼠18只,制作右侧坐骨神经损伤模型,模拟临床常见的神经外膜相对扭转的缝合方法,分别于术后1、2、3周取缝合点远近各2 mm长坐骨神经标本,采用GFAP、Sox2、Krox20抗体标记许旺细胞. 结果 术后各观察点许旺细胞的GFAP表达均高于正常,且1周时表达最为明显;未见Sox2表达;术后1周Krox20几乎不表达,2、3周时Krox20的表达均高于正常,且Krox20阳性的许旺细胞明显增殖. 结论 通过免疫标记方法可以反映修复不同阶段许旺细胞的分化状态;对此现象的观察有利于判断神经再生状态并寻找影响神经再生的因素.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的　研究胶质细胞源性神经营养因子 (glialcellline derivesneurotrophicfactor ,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用。方法　应用体外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物管 (polyCDL lactide co glycolide ,PLGA)构建的神经移植复合体 ,修复大鼠坐骨神经的缺损。 2 0只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为 4组 ,每组 5只。A组 :细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;B组 :雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;C组 :GDNF基因修饰的雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;D组 :自体神经桥接组。术后 12周检测运动神经传导速度 ,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析。结果　术后 12周 ,坐骨神经的运动神经传导速度 ,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓前角运动神经元存活率等 ,C组均优于A、B组 (P <0 .0 1) ,而与D组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足 ,而达到与自体神经移植相似的效果。     

大鼠坐骨神经损伤后许旺细胞源神经营养因子表达的实验研究

目的 观察坐骨神经在正常和损伤后许旺细胞源神经营养因子的表达。方法 将75只SD大鼠坐骨神经地夹伤、切断、切断加缝合等,术后第5、7、14、30、60d取材,做常规免疫组织化学研究。结果 （1）正常坐骨神经和脊髓中许细胞源神经营养因子有较弱表达;（2）切断组坐骨神经近段术后第14d许旺细胞源神经营养因子表达最高,远段第7d最高,脊髓术后第5d最高;切断缝合组和夹伤组神经和脊髓部以术后第60d最高;（3）损伤侧灰质后角表达强于对照侧。结论 (1)许旺细胞源神经营养因子在正常神经和脊髓中有较弱表达;(2) 旺细胞源神经营养因子在坐骨神经不同损伤情况下表达不同,但都高于正常组;（3）许旺细胞对神经损伤后修复作用可能通过许旺细胞源神经营养因子实现。     

坐骨神经切断后GDNF mRNA在两侧断端的表达变化

目的探讨大鼠坐骨神经切断后,GDNFmRNA在两侧断端的表达变化及其意义。方法切断SD大鼠左侧坐骨神经,在不同时间、应用半定量RT-PCR方法观察两侧断端GDNFmRNA的表达变化。结果坐骨神经切断前,GDNFmRNA在两侧坐骨神经微量表达,坐骨神经切断后远断端表达逐渐增加(1、7、14、28d分别增加20%、60%、85%、90%),近断端表达逐渐减少(1、7、14、28d分别减少10%、38%、45%、52%)。结论坐骨神经切断后断端GDNFmRNA表达变化是由于“胞体-轴突-靶器官”轴中断造成的。此结论为应用外源性GDNF治疗脊髓损伤提供了理论依据。     

感觉性和运动性神经来源许旺细胞神经生长因子的表达

目的;研究感觉性和运动性许旺细胞神经生长因子的表达是否有区别,进而探讨对神经特异性再生的影响。方法：体外培养高纯度的运动性许旺细胞,每种细胞分别在常规和添加白细胞介素－1培养基中培养,用双抗体夹心ELISA法测量不同时间培养培养基中神经生长因子表达量。结果：两种培养条件一,感觉性许旺细胞的神经生长均呈双峰状,第二峰较第一峰明显增高,运动性许旺细胞的表达在第6、7d达峰值,但总体水平较感觉性许旺细胞为低。结论：两种许旺细胞神经生长因子的表达量和特点具有差别,这种差别可以为解释神经特异性再生提供依据。     

中药治疗对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子蛋白表达的影响

目的：研究党参、丹参、黄芪、生地等单味中药及复方神肌再生冲剂对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子（nerve growth factor,NGF)蛋白表达的影响。方法：雄性SD大鼠108只，按手术先后随机分成党参、丹参、黄芪、生地、复方神肌再生冲剂和对照组6组，每组18只。按取材时间分为术后2、4、8、周3个时间组（每组6只）。显露大鼠右侧坐骨神经，于坐骨结节远端0.8cm处造成坐骨神经挤压伤。根据分坐骨神经干，应用免疫组织化学和图像分析的方法研究神经组织中NGF的表达并进行定量分析。结果：术后4、8周组，丹参和复方神肌再生冲剂组，坐骨神经组织中的NGF蛋白高表达。结论：大鼠坐骨神经损伤后用中药丹参和复方神肌再生冲剂治疗，可促进坐骨神经组织NGF蛋白表达。     

同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的研究

目的 用种植胎兔雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体修复兔缺损的坐骨神经,观察坐骨神经再生及功能恢复.方法 健康成年新西兰白兔48只,体质量1.5-2.0 kg,随机分成2组.两组动物均切除一段坐骨神经,造成2.0 cm长的缺损.实验组:用种植胎兔雪旺细胞的同种异体神经复合体修复坐骨神经.对照组:仅用去细胞同种异体神经修复.术后4、8、16周进行大体观察、标本光镜和电镜观察且进行量化分析、肌湿重检测.结果 手术区局部均未出现明显的排斥反应,实验组足部溃疡愈合情况优于对照组,实验组再生神经纤维数目、有髓神经纤维轴突直径、髓鞘厚度4、8、16周分别为(906.25±30.68,1726.25±51.89,2825.13±22.79)、(5.35±0.62,5.46±0.38,5.59±0.80),(1.65±0.37,1.75±0.41,1.83±0.49)均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).小腿三头肌湿重于术后4周两组间差异无统计学意义(P>0.05),实验组术后8、16周分别为(5.62±0.99,7.38±0.26)恢复优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体对神经再生及功能恢复有更好的促进作用.     

电针对大鼠坐骨神经再生影响的功能评价

目的从功能恢复评价电针对神经再生的促进作用。方法建立大鼠坐骨神经损伤模型，将９０只ＳＤ大鼠随机分为损伤对照组和电针组两组。分别于术后２、４、６、１０周测定运动神经传导速度、小腿三头肌肌力及坐骨神经功能指数，并以自身健侧作对照得出其恢复率。同时测定术后１周感觉神经再生的距离。结果电针组术后１周感觉神经再生距离及２、４、６、１０周运动神经传导速度、肌力、ＳＦＩ等的恢复率均明显优于对照组。结论电针可以促进损伤神经的再生，明显提高神经功能的恢复