Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

表达反义N－myc基因逆转录病毒载体的构建

表达反义Ｎ－ｍｙｃ基因逆转录病毒载体的构建陈杰，刘彤华，王志永，崔全才，李和伟，郭洪涛，高洁（中国医学科学院，中国协和医科大学协和医院，北京１００７３０）关键词逆转录病毒载体；Ｎ－ｍｙｃ基因中图号Ｒ７３０．２Ｎ－ｍｙｃ癌基因是ｍｙｃ族癌基因的重要成员...     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的：构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA（MDR1）,并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法：根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。 用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Western blotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果：重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60 bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDR mRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论：逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。     

表达人生长激素的逆转录病毒载体的构建

目的：建立一个表达人生长激素（hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统，为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术，用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3，获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子（mMT-1)和人生长激素（hGH)基因片段，将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切，正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段；同时，应用巢式PCR鉴定目的片段，扩增片段大小约1.119kb，与预期结果相符。结果：表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论：人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

反义及正义Vim重组逆转录病毒表达载体的构建

目的构建反义及正义波形蛋白重组逆转录病毒载体，研究波形蛋白在反应性胶质化中的功能与作用。方法应用分子克隆方法克隆、鉴定、包装并感染培养的星形胶质细胞。结果同时获得全长反义及正义Vim逆转录病毒克隆细胞株和较高滴度的病毒上清，反义Vim逆转录病毒抑制培养星形细胞的Vim表达。结论重组的反义及正义Vim逆转录病毒可用于进一步的实验研究。     

IRF4逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的将小鼠IRF4基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,得到长期稳定表达IRF4的逆转录病毒载体.方法以含IRF4 cDNA质粒作为模板,PCR扩增所需目的片段;将该片段连接入MSCV-IRES-GFP质粒;以磷酸钙法转染293T细胞,收集病毒上清感染GP+E86细胞后,流式细胞术和蛋白印迹技术检测IRF4的表达.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的片段成功连接到逆转录病毒MSCV载体上.逆转录病毒上清成功感染GP+E86细胞系.结论成功构建了小鼠IRF4逆转录病毒表达载体,并实现了IRF4在GP+E86细胞系中的外源性表达.     

Bcl－2和反义bcl－2逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

Ｂｃｌ－２和反义ｂｃｌ－２逆转录病毒表达载体的构建与鉴定朱峰，金明，惠宏襄，赵永同，王成济（生物化学及分子生物学教研室西安７１００３３）关键词细胞凋亡；ｂｃｌ－２基因；逆转录病毒载体中图号Ｒ７５３为了研究ｂｃｌ－２与肿瘤细胞的关系，我们构建了正义和反...     

人白介素10逆转录病毒表达载体的构建

目的构建一个人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体,为研究hIL-10的生物学活性打下基础.方法用限制性内切酶消化提取质粒pCDHIL-10中hIL-10全长cDNA,采用定向克隆的方法将hIL-10基因插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中,经转化、扩增、限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL-10基因成功插入到逆转录病毒载体pLXSN的中.结论成功完成了人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体的构建,为今后进一步研究hIL-10的生物学活性打下了基础.     

HLA-DRα基因片段TA克隆载体的构建

目的应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体，作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因的标准模板。方法利用RT-PCR法，从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLADRα cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论成功地构建了HLA-DK基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-Dα,mRNA表达提供标准模板。     

反义BMP2逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

0　引言　骨形成蛋白 (Bone Morphogenetic Protein,简称BMP) 2在骨肉瘤中有较高的表达并影响骨肉瘤的生物学活性 ,引起骨肉瘤的预后不良 .为了进一步研究 BMP2在骨肉瘤细胞中的作用机制并为探讨骨肉瘤反义核酸技术治疗的可行性 ,我们构建了反义 BMP2的逆转录病毒表达载体 .1　材料和方法1.1　材料　含 BMP2的 PSP6 4质粒由美国基因研究所 Dr.Wonzey馈赠 ,由 1.6 4kb的人 BMP2 c DNA克隆至 PSP6 4的Eco RI位点而成 .PGEM- 3Z(+ ) (2 .74kb,含 Eco RI,Smal I和 Sal I位点 )和逆转录病毒表达载体 PDOR(6 .5 kb,含Eco RI…     

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验 ,同时 ,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法 [1 ] .迄今所掌握的研究资料表明 ,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应 .因此 ,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体 p L XSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(s Fv- TNF-α)克隆至该载体 ,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究 .1　材料和方法1.1　材料　分泌型抗肝癌单链…     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

抗凋零基因bcl－2逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

抗凋零基因ｂｃｌ－２逆转录病毒表达载体的构建与鉴定陈协群，王文亮，王成济，黄高升，沈素芸（西京医院血液科病理学教研室生物化学教研室）关键词调零；ｂｃｌ－２基因；逆转录病毒表达载体中图法分类号Ｒ７５３基因转染是探讨人ｂｃｌ－２基因调控细胞凋零（ａｐｏｐ...     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建

目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.