基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法,采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉,13份锁阳以及8份黄花列当,所有样品进行总DNA提取,通过对其ITS片段进行扩增,测序。再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化;另外,对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。结果显示,该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中,荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带,而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带,从而实现了正伪品的鉴别。该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化。结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05~1 ng,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。     

多重位点特异性PCR鉴别海龙及其混伪品

目的:建立一种高效、准确的中药材海龙及其常见混伪品的特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法:通过比较海龙及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因序列差异,根据变异位点设计刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物,优化反应体系,并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上,将3对特异性引物组合,构建多重PCR体系。结果:在多重PCR体系中,刁海龙能扩增出485 bp片段,尖海龙可扩增出120 bp片段,拟海龙可以扩增出240 bp片段,其他混伪品均无条带。所设计的特异性鉴别引物具有高度的特异性。结论:该文所建立的位点特异性PCR鉴别方法可实现海龙的准确鉴别。     

多重位点特异性PCR同时鉴别酸枣仁及其掺伪品

目的：优化并建立多重位点聚合酶链式反应（PCR）体系同时鉴别酸枣仁、枳椇子和理枣仁及不同掺伪量,解决酸枣仁药材商品及其制剂的掺伪难题。方法：通过分析比对酸枣仁及其伪品的内部转录间隔区（ITS）序列差异找到特异性单核苷酸多态性（SNP）位点,设计特异性鉴别引物,通过优化退火温度、循环次数及引物浓度,评估不同聚合酶种类和不同PCR仪等扩增条件对不同来源的酸枣仁、枳椇子及理枣仁样品进行特异性扩增,根据特异性扩增条带大小进行鉴别,并对最低检测限和掺伪检出限进行研究。结果：在退火温度为63℃,循环次数为23次时,酸枣仁、枳椇子和理枣仁分别扩增出549、169、389 bp的特异性条带。该方法对酸枣仁和理枣仁的最低检测限为0.24 ng,枳椇子为1.2 ng,对酸枣仁、枳椇子和理枣仁的掺伪检出限分别为0.5%、2%和2%。结论：该文建立的多重位点特异性PCR鉴别方法能同时准确鉴别酸枣仁、枳椇子和理枣仁,对解决酸枣仁药材掺伪问题提供基础研究,为控制酸枣仁药材质量安全及临床应用提供参考。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别北柴胡掺伪藏柴胡

目的 基于ITS序列建立北柴胡掺伪藏柴胡的分子鉴别方法.方法 收集北柴胡、藏柴胡样品,提取基因组DNA,用ITS通用引物进行测序,通过DNAMAN软件进行序列比对,根据藏柴胡特异性位点用Primer Premier 5.0软件设计特异性鉴别引物,并优化特异性PCR反应条件.结果 在位点特异性PCR反应条件考查中,退火温...     

基于ITS2序列SNP位点鉴定白及药材及其混伪品

为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增rDNA ITS2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点。结果显示,ITS2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点。针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412R,HHBJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生。该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法。     

基于ITS2条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别

目的 利用ITS2条形码鉴别两面针药材及其混伪品,为两面针药材鉴定提供新方法.方法 采用PCR法扩增ITS2(转录第二间隔区)序列,双向测序后运用CodonCode Aligner、MEGA软件进行数据处理,构建系统聚类树(NJ树).结果 两面针药材及其混伪品基因组DNA降解明显,但不影响ITS2条形码的PCR扩增和测序,ITS2条形码序列分析表明种内与种间遗传距离具有较大差异,基于ITS2条形码构建NJ树可鉴别两面针药材及其混伪品.结论 ITS2条形码适用于两面针药材及其混伪品的鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据;同时为DNA条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用.     

基于ITS2序列位点特异性PCR鉴别广藿香及其混伪品

目的建立一种简便、准确鉴别广藿香及其混伪品的方法。方法通过对GenBank数据库收录的广藿香及其混伪品的ITS2序列进行对比分析,根据差异位点设计位点特异性鉴别引物,并优化PCR条件,对广藿香新鲜植物、干燥药材、含广藿香中成药及其混伪品进行扩增和检测。结果广藿香新鲜植物、干燥药材及含广藿香中成药均扩增出162 bp条带,而广藿香的混伪品均无条带,且该方法灵敏度高,检出限可达0.3 g·L~(-1)。结论所建立的位点特异性PCR方法可实现广藿香的准确鉴别,具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。     

基于ITS2条形码鉴别半枝莲及其混伪品

目的:运用Internal Transcribed Spacer 2(ITS2)条形码对半枝莲及其混伪品进行鉴别研究,为该药材的安全用药提供依据。方法:提取样品基因组DNA,对ITS2序列进行PCR扩增和双向测序,所得序列经Codon Code Aligner V5.0.2.0拼接,采用MEGA6.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离。采用最近距离法(Nearest Distance)和构建邻接树(NJ Tree)分析ITS2条形码对半枝莲的鉴定能力。结果:半枝莲ITS2序列种内遗传距离为0~0.008 4,与其混伪品半边莲、韩信草和荔枝草的种间遗传距离分别为0.354 7~0.369 6、0.044 2~0.054 2、0.271 9~0.301 8。半枝莲种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定半枝莲与其混伪品。基于ITS2序列构建的NJ树也可将半枝莲及其混伪品明显区分开。结论:ITS2序列可以快速、准确鉴别半枝莲与其混伪品,是鉴别半枝莲、保障其药材质量的有效条形码。     

ITS2序列鉴定小茴香及其常见混伪品

目的 探讨基于ITS2序列鉴定小茴香及其混伪品的新方法.方法 对小茴香4份样品的ITS2序列进行PCR扩增和测序,同时从GenBank上下载小茴香及其常见混伪品共6个物种42个样本.用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各物种间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列构建其系统发育树.结果 小...     

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列位点特异性聚合酶链反应鉴别鹿茸及其伪品

目的:基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列建立一种新的PCR鉴定方法,以快速鉴别出梅花鹿、马鹿茸片与驯鹿茸片。方法:采集不同来源的鹿茸片共60批。通过比较梅花鹿、马鹿与驯鹿等其他伪品的COⅠ基因序列差异,根据SNP鉴别位点设计梅花鹿茸、马鹿茸同驯鹿茸的鉴别引物Cne-F、Rt-F、Co-R,并对影响聚合酶链反应(PCR)结果的主要因素变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间等进行方法学考察和优化。结果:该实验构建的双位点特异PCR鉴别体系,基于COⅠ的鉴别位点,可通过PCR扩增获得294 bp的梅花鹿、马鹿特异片段,而产生514 bp的驯鹿特异片段,伪品及阴性对照无条带。结论:该实验建立对梅花鹿、马鹿及驯鹿等其他伪品鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。     

荚蒾属植物DNA条形码鉴定

目的:通过分析13种荚蒾属药用植物的ITS2(internal transcribed spacer 2)条形码序列,探讨荚蒾属植物属内鉴定的新方法,为荚蒾属植物的快速、准确、批量鉴定提供方法学依据。方法:该研究收集13种荚蒾属植物共32份样品,进行基因组DNA提取、PCR扩增ITS2序列并测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接并剪切后,采用MEGA5.1软件计算遗传距离,比较种内、种间序列差异,利用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统聚类树。结果:基于ITS2序列分析,13种药材种间存在明显差异,各个种的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离;构建的系统树各个种不同样本均分别聚在一起,表现出单系性。结论:ITS2序列作为DNA条形码可较好地用于荚蒾属植物的鉴定研究,有助于为荚蒾属植物鉴定提供分子生物学方法基础,也为日后荚蒾属植物的开发打下坚实基础。     

ITS2序列鉴定十大功劳属药用植物

目的:基于ITS2序列鉴定十大功劳属药用植物,以避免该属物种药用基原混乱。方法:收集十大功劳属物种作为实验材料,采用改良的CTAB法提取总DNA,经PCR扩增、双向测序和序列拼接,应用MEGA 6.0对该属13个物种43条ITS2序列进行序列变异分析,计算种内种间Kimura 2-parameter(K2P)距离,构建系统邻接(NJ)树。结果:十大功劳属13个物种43条ITS2序列分析结果表明,各物种种内最大(平均)K2P距离均不大于种间最小(平均)K2P距离;系统NJ树结果显示,十大功劳属其中9个物种各自聚为一支。结论:ITS2序列对十大功劳属药用植物具有较好鉴定效果,为该属药用植物的临床用药安全提供了分子依据。     

基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定

目的：通过DNA条形码鉴定技术区分中药材藤梨根及其常见混伪品。方法：对采集的中药材藤梨根样品及其常见混伪品进行DNA 提取,PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner 3.5.7对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA 5.0软件计算藤梨根及其常见混伪品的Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建NJ（邻接）系统聚类树,最后分析种间ITS2序列的二级结构差异。结果：中药材藤梨根两种基原植物的平均种内K2P遗传距离分别为0.001和0.002,远小于藤梨根与其常见混伪品之间的平均K2P遗传距离0.120;藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异;NJ树显示藤梨根的基原植物聚在一起,与混伪品可明显区分,但无法区别所有猕猴桃属植物。结论：ITS2序列可高效区分藤梨根及其常见混伪品,弥补了传统鉴定方法的不足,提高了鉴定效率及准确性。     

基于PCR-核酸试纸条快速鉴定鹿茸及其伪品的实验研究

目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^-1。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。     

基于ITS2序列的博落回属植物鉴定研究

目的:采用ITS2序列对博落回属药用植物进行鉴定。方法:通过对来自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陕西、重庆的30个博落回属植物ITS2序列进行扩增和测序,并对其进行扩增效率及测序成功率、碱基构成、种内和种间变异分析及NJ系统进化树分析来评估ITS2序列鉴定效果。结果:博落回属药用植物ITS2序列长度在500 bp以内,扩增效率和测序成功率为100%,并获得30条博落回ITS2序列。结论:ITS2序列可以有效准确鉴别博落回属植物。     

基于ITS2序列的苍术属植物遗传关系

目的:应用内部转录间隔区2(ITS2)序列鉴定东北产栽培和野生苍术及其近缘种药材,明确其种间遗传关系远近,并对东北产朝鲜苍术的栽培起源进行初步探索。方法:提取不同栽培区包括北苍术、朝鲜苍术在内的五种苍术属40份样本以及朝鲜苍术7份野生种质样本的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS2序列并进行双向测序,所得所有序列用MEGA5. 0软件进行比对分析(clustal W),去除两端5. 8S和28S序列,获得完整的ITS2序列,构建系统聚类树(NJ树)。结果:苍术属5种药材ITS2序列长度均为232 bp。根据NJ树和ITS2二级结构结果,除北苍术和朝鲜苍术未被区分开,其余几种药材均可明显区分,表现出良好的单系性。根据NJ树结果可知,朝鲜苍术的栽培品系和野生种质也能很好的聚在一起。结论:ITS2序列能稳定、准确鉴别苍术属5种药材。朝鲜苍术与北苍术亲缘关系很近,可认为是苍术北方分支中的一种变种,建议将朝鲜苍术并入北苍术。且在辽宁有大规模栽培的朝鲜苍术可能起源于辽宁本地的野生群体,种源可能来自于辽宁岫岩等地的野生种。     

苍耳子药材及其混伪品ITS2 序列鉴定研究

目的：应用ITS2 序列快速并准确地鉴定中药材苍耳子,为其药材质量、用药安全提供保障。方法：提取苍耳子药材及其混伪品的基因组DNA、扩增ITS2 序列并测序,采用软件CodonCode Aligner V 4. 2 对测序峰图进行校对拼接,并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.0 软件计算种内种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：苍耳子药材基原物种种内K2P 遗传距离为0,药材基原物种与其他混伪品的K2P 遗传距离分布于0.009~0.542;NJ 树结果显示苍耳子药材与其混伪品均可明显区分。结论：ITS2 序列适用于中药材苍耳子及其混伪品鉴别,进一步验证了DNA 条形码技术鉴定中药材的有效性。     

大孔吸附树脂分离纯化红枣总黄酮的研究

目的筛选出分离纯化红枣总黄酮的最佳大孔树脂型号及工艺条件。方法以静态吸附和解吸率为指标考察5种大孔树脂,优选出分离纯化红枣总黄酮的树脂类型,并确定分离纯化红枣总黄酮的工艺参数。结果 D101型大孔吸附树脂对红枣总黄酮的最佳吸附条件为:上样液质量浓度为0.403mg/mL,上样液pH值为3.0,吸附流速为3.0BV/h,上样液体积为4倍树脂体积,洗脱剂用80%的乙醇,洗脱流速为2.0 BV/h,洗脱剂的用量为6倍的树脂体积,分离纯化后红枣总黄酮的含量能达到19.5%。结论该研究为红枣总黄酮的吸附及脱附提供了实验研究数据。     

中药龟鳖甲的商品鉴定

目的 :鉴定鳖甲、龟甲类商品药材。方法 :形态鉴定及差热分析法。结果 :发现鳖甲伪品 2种 ,龟甲伪品 3种 ,并提出鳖甲、龟甲类药材的形态和差热鉴定特征。结论 :目前市售的海鳖甲系伪品鳖甲 ,其原动物为产于南亚地区的缘板鳖及鼋 ,花龟、海龟及太平洋丽龟甲为伪品龟甲 ;利用形态及差热分析特征可将鳖甲、龟甲与其伪品准确区分开。