乙肝病毒基因前C区突变与临床关系的研究

应用巢式ＰＣＲ结合碱性磷酸酶标记的ＡＳＯ探针杂交技术和ＤＮＡ测序技术对１２７例乙肝病毒（ＨＢＶ）感染后的血清标本进行了ＨＢＶ基因前Ｃ区突变的检测。结果发现：５３例为突变株感染，其中３２例为无症状携带者；１５例为慢性肝炎患者；肝硬化和肝癌患者各３例。在１２７例标本中发现４种新生突变：Ｉ１０Ｎ、Ｃ１２Ｗ、Ｃ１４Ｓ和Ｖ１７Ｆ，和４种不同数目核苷酸的插入片段。本研究认为ＨＢＶ基因前Ｃ区突变不一定导致病情加重。碱性磷酸酶标记的ＡＳＯ杂交技术安全可靠，特别适用于临床多样本的突变检测。     

苯丙酮尿症的基因诊断

生物素－－链抗生物素蛋白系统的固相技术，对ＰＣＲ扩增后ＤＮＡ片段进行直接顺序分析，检测了系统地区１３例经典型ＰＫＵ患者ＰＡＨ点突变，结果表明，１３例ＰＫＵ患者中检出７种点突变；发现７种ＰＡＨ基因突变组合类型，其中空谈４３Ｑ、Ｒ４１３Ｐ、Ｙ２０４Ｃ和Ｒ１１１Ｘ是分别位于ＰＡＨ基因第７、１２、６和３外显子处的４种常见突变。本研究准确可靠导确定了ＰＡＨ基因分子缺陷的遗传机理，为该疾病的基因治疗提供了科学     

应用碱性磷酸酶标记探针检测苯丙酮尿症突变基因

为建立一种简便易行。快速可靠的检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的方法,应用PCR技术扩增PAH基因外显子3,5,6,7,10,11,12序列,以碱性磷酸酶标记的ASO探针进行Southern印迹杂交,从而直接检测PAH基因突变,结果在15例患者中,检测出7种点突变,该结果与测序分析结果(另文发表)一致。证明碱性磷酸酶标记的PCR-ASO探针杂交法可快速、简便、准确、安全、可靠地检则PAH基因点突变,在PKU筛查中具有广泛应用价值。     

石蜡包埋的石棉肺癌组织中p53基因突变的分析方法

为了利用石蜡包埋的病理组织来研究石棉肺癌的基因突变情况，选用１０例石蜡包埋的石棉肺癌组织进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析，检测其抗癌基因ｐ５３的第５、第７和第８外显子的突变情况。经银染检查，发现４个病例的ｐ５３基因的第７或第８外显子片段呈突变阳性。用放射性自显影的ＰＣＲ－ＳＳ－ＣＰ方法分析这１０例病例，检测到７个病例的ｐ５３基因第７或第８外显子片段呈突变阳性。用两种方法检测均未发现这１０个病例的第５外显子呈突变阳性。银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测可检出放射性自显影ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果的６０％，二者的结果相符合。因而，简便、灵敏而且危害性小的银染检测方法，可以代替放射性自显影用于ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析，研究石棉肺癌的基因突变情况。     

原位分子杂交检测HFRSVRNA方法研究

采用非放射性标记物－地高辛碱性磷酸酶标记肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）ｃＤＮＡ制备分子探针，检测ＨＦＲＳＶ在鼠肺、恙螨体内分布定位，并对原位分子杂交的各环节进行探讨。结果表明：鼠肺的吞噬细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞等均见有阳性颗粒，在恙螨卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞也存在阳性颗粒；在前处理中，明胶硫酸铬钾与多聚赖氨酸的铺片效果相似；室温２ｈ，４２℃１ｈ，４％多聚甲醛处理冰冻切片，可有效防止脱片，且保持良好的细胞形态结构；探针ＰＣＲ标记法优于随机引物标记法；预杂交液加入ｓｐｅｒｍＤＮＡ和ｙｅａｓｔｔＲＮＡ，不用硫酸萄聚糖，可有效地减少背景染色；４２℃杂交１６ｈ，显色７ｈ可得到理想结果     

恙螨体内肾综合征出血热病毒基因的套式PCR检测

目的：检测恙螨体内微量肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）基因。方法：选择ＨＦＲＳＶ膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成两对引物，采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ，建立了反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法，扩增产物经凝胶电泳及点印迹杂交证实具有特异性。结果：ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离恙螨５０只组，经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性；ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组，ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只、１０只和５只组，游离螨１０只和５只组均未见明显扩增带。进一步用ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ检测，在ＲＴ－ＰＣＲ未检测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，最低检出为５只螨组。并用核酸分子杂交技术进一步证实了上述结果。结论：ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点，可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，从分子生物学角度为恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了直接证据。     

应用克隆杂交和聚合酶链反应技术检测TDH基因

目的建立快速、敏感、特异和精确的方法检测致病性副溶血弧菌（ＶＰ）。方法在耐热 溶血毒素（ＴＤＨ）结构基因序列的基础上,自行设计探针和引物,应用克隆杂交方法检测３０株不同 来源的ＶＰ,同时对１０株不同ＫＰ反应的ＶＰ ＤＮＡ行ＰＣＲ－ＴＤＨ检测。结果３０例实验菌株,２６ 例ＫＰ阳性株克隆杂交出现阳性信号,其余４例杂交阴性（２例ＫＰ弱阳性、２例ＫＰ阴性）。用ＰＣＲ 检测的１０株ＶＰ中,６例ＫＰ阳性株ＴＤＨ基因均阳性,但有１株ＫＰ弱阳性和１株ＫＰ阴性株也呈 ＴＤＨ基因阳性。ＰＣＲ阳性结果均用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法证实。结论应用克隆杂交技术检测ＴＤＨ基 因在合适的条件下能有效地鉴别致病性与非致病性ＶＰ。 ＰＣＲ检测ＴＤＨ基因为研究ＶＰ的致病机 理奠定基础,在临床上可作为一种检测致病性ＶＰ的快速敏感的初筛试验。     

胃癌组织P53基因突变类型分析

为了探讨胃癌病因，我们用聚合酶链式反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术分析了胃癌高发区胃癌组织Ｐ５３基因的改变。９０例胃癌中有４５例Ｐ５３基因发生改变，其中３９例为点突变，６例为缺失和插入突变，Ｐ５３基因点突变以Ｇ→Ａ和Ａ→Ｇ突变为主（６６．７％），Ｇ→Ｔ和Ｔ→Ｇ占１５．５％，这些结果提示Ｐ５３基因改变与胃癌的发生有密切关系，并根据碱基突变特点分析了可能存在的环境致癌物为甲基化致癌物和多环芳烃类致癌物     

石棉肺癌组织中p53基因突变的PCR-SSCP及部分序列分析研究

为研究石棉致癌的分子机理，本研究首次直接分析石蜡包埋的石棉肺癌病例肺组织中抗癌基因ｐ５３的突变情况。利用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术分析１０例石棉肺癌病例，检测到７例（８个片段）存在ｐ５３基因的突变，突变位点位于其第５、７和８外显子区内，突变率为７０％。对其中２例进行ＰＣＲ产物直接序列分析，发现其基因一级结构分别发生Ｃ→Ａ和Ｔ→Ａ转换。     

随机引物聚合酶链反应对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型的研究

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）随机引物聚合酶链反应（ＡＰ－ＰＣＲ）基因分型的方法用于；临床流行病学调查。方法优化ＡＰ－ＰＣＲ方法并与抗生素敏感谱分型法比较，评价ＡＰ－ＦＣＲ基因分型法的可靠性与分辨力；并对４９株ＭＲＳＡ进行ＡＰ－ＲＣＲ基因分型。结果４９株医院感染的ＭＲＳＡ可分为１０个ＡＰ－ＰＣＲ谱型，主要谱型为 Ａ３型，分型率 １００％；其中 ４１株 ＭＲＳＡ为流行病学相关株。结论 ＡＰ－ＰＣＲ基因分型是一种经济、快捷、可靠的分型方法；是在分子水平上对微生物感染进行病原学、发病机理及流行病学研究较理想的工具。     

磷氧氮丙啶诱发CHO细胞HGPRT基因位点正向突变的分子特征

ＭＡＰＯ诱发的ＣＨＯ细胞ＨＧＰＲＴ基因位点突变克隆ＤＮＡ，经ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ酶切消化后，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交法，与ＨＧＰＲＴ基因探针杂交。从杂交图谱可见，正常ＣＨＯ细胞基因组ＤＮＡ经ＰｓｔＩ酶切后杂交可显出６条杂交带，其中８３ｋｂ，７６ｋｂ，６０ｋｂ，和３２ｋｂ带为Ｘ染色体连锁的ＨＧＰＲＴ基因所有，分别代表外显子２，６８，４和３，其余两条带为假基因。而经ＥｃｏＲＩ酶切后，正常ＣＨＯ细胞基因组ＤＮＡ有１７５ｋｂ和１１３ｋｂ两条ＨＧＰＲＴ基因杂交带，分别代表了外显子６９和２４。而从ＭＡＰＯ所诱发的ＨＧＰＲＴ基因突变细胞杂交图谱可见，其主要改变是ＨＧＰＲＴ基因全部缺失或部分缺失，同时出现了新的杂交带。ＰｓｔＩ酶切的７个突变克隆均显出基因缺失或新的杂交带型，而ＥｃｏＲＩ酶切８个突变克隆中，有３个无ＨＧＰＲＴ基因改变。由此可见，ＭＡＰＯ诱发ＨＧＰＲＴ基因位点突变的分子机理主要是由于基因缺失或重排。     

聚合酶链反应扩增HDV基因序列

用两对ＨＤＶＯＲＦ５区引物作逆转录套式ＰＣＲ，检测６例抗－ＨＤ阳性的慢性乙型肝炎患者血中ＨＤＶＲＮＡ．结果，５例在３５９ｂＰ处出现特异性扩增带，用地高辛标记的寡核苷酸探针杂交核实结果与溴化乙锭染色者一致，未发现有假阳性结果．提示用该法检测本地区ＨＤＶＲＮＡ可获得较理想的结果．     

戊型肝炎病毒结构区编码多肽检测相应抗体方法的建立及应用

建立一种新的检测嗜肺军团菌ｍｉｐ基因的引物双标记聚合酶链反应—酶联免疫吸附（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）法,应用于豚鼠军团菌感染的早期检测和诊断。其方法是将一对嗜肺军团菌引物分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素,经ＰＣＲ扩增后,将标记有生物素的ＰＣＲ扩增产物加入链酶亲和素包被的微孔板中,洗去未结合物后直接加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体,待与荧光素结合后,再加入底物产生显色反应,ＥＬＩＳＡ仪测得Ａ值。通过对该系统的作者单位：２０００４０上海医科大学华山医院传染病学教研室（朱利平、石尧忠、陈一平、邬祥惠、翁心…     

肺癌中p53基因突变类型和可能致癌因素分析

为了研究肺癌中ｐ５３基因的作用及突变类型与不同致癌物的可能关系，用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ核酸序列技术分析了原发非小细胞肺癌中ｐ５３基因的突变谱，结果发现１２８例中９４例发生突变，其中８６例为点突变，７例为缺失和插入突变，１例为拼接部位突变。点突变以Ｇ→Ｔ和Ｔ→Ｇ突变为主（６３．９％），Ｇ→Ａ和Ａ→Ｇ占２５．６％，这些结果提示ｐ５３基因突变与非小细胞肺癌发生有密切关系，并根据其突变特点分析了可能的环境致癌物。     

应用多重引物PCR技术检测O157∶H7毒力基因

目的 对江苏省６个不同地区不同宿主动物中分离的Ｏ１５７：Ｈ７菌株进行毒力基因的检测分析。方法 应用肠出血性大肠杆菌（ＥＨＥＣ）的多重引物聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,以志贺祥毒素（ＳＬＴ２和ＳＬＴ１）基因、“粘附抹平”因子ｅａｅＡ基因和溶血素（ｈｌｙ）基因为靶基因进行检测。结果 江苏省分离的Ｏ１５７：Ｈ７菌株毒力基因携带率为５６．５％,不同地区的分离株携带率有所不同,个别地区高达９０％以上,有的地区     

基因突变检测方法进展

直接基因突变的研究是近年来国内外生物医学研究领域中最热门的内容之一。本介绍了一些基因突变检测方法，包括筛选未知突变的方法ＲＮａｓｅ，ＳＳＣＰ，ＤＧＧＥ（ＣＤＧＥ、ＴＧＧＥ、ＴＳＧＥ）、ＣＣＭ、ＨＥＴ、ＣＯＩ、ＤＳ法及诊断已知突变的方法如杂交法、扩增法（ＡＲＭＳ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＬＣＲ）及ＭＲＥＣ法。这些方法各有长短，然而数种技术的巧妙组合可能取长补短，形成一个完整的基因突变检测系统。     

对套式多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒核酸效果的评价

用套式多聚酶链反应和普通ＰＣＲ法检测丙型肝炎病毒核酸比较。ＮＰＣＲ溴化乙锭染色法结果与＾Ｐ标记探针核实结果完全一致，无漏检，也无假阳性，可不用＾Ｐ标记探针核实。ＮＰＣＲ法的敏感性为普通ＰＣＲ溴化乙锭染色法的２倍，为普通ＰＣＲ加探针法的１．１７倍。     

多基因PCR检测产毒性大肠杆菌和志贺氏菌的研究

为了提高普通的单基因ＰＣＲ检测致病性肠道杆菌的时效，采用ＥＴＥＣ４４８１３（ＬＴ）、ＥＴＥＣ１９４４９（ＳＴ）和福氏２ａＴ３２（ｉｐａＨ）３个标准株为模板，建立了检测产毒性大肠杆菌（ＬＴ，ＳＴ）和志贺氏菌的三基因ＰＣＲ方法。并分别用相应单基因ＰＣＲ方法标记的探针斑点杂交标准株ＥＴＥＣ４４８１５（ＬＴ）、工程株ＰＳＬＭ００４（ＳＴ）和标准株４８０２５１１（ｉｐａＨ）。杂交的结果都是阳性，证实了这个多基因ＰＣＲ扩增是特异的。并用此三基因ＰＣＲ反应系统检测１１３株ＥＴＥＣ和志贺氏菌，结果是ＬＴ２５株、ＳＴ１６株、ＬＴ和ＳＴ共３０株及ｉｐａＨ４２株。在几种病原体可能共存的样本中，用一次ＰＣＲ就能解决病原体的检测和鉴别问题，比单基因ＰＣＲ更快速、经济。     

耐甲氧西林葡萄球菌感染基因诊断的实验研究

目的探明沈阳地区ＭＲＳＡ感染状况及耐药机理。方法采用酶标－多聚酶链式反应（ＥＤ－ＰＣＲ）方法对沈阳地区３所医院分离的７６株葡萄球菌耐甲氧西林（ＭｅｃＡ）基因进行检测。结果ＭｅｃＡ基因阳性２３株，耐甲氧西林葡萄球菌（ＭＲＳ）的检出率为３０．３％，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）检出率占金黄色葡萄球菌总数的２１．７％。采用微量液体稀释法、琼脂稀释法以及ＭＲＳＡ鉴别培养法等３种方法与之相比较，经统计学处理ＥＤ－ＰＣＲ法与其它３种方法的一致性非常有意义（Ｐ＜０．０１）。以ＭＲＳＡ鉴别培养法作为诊断ＭＲＳ的参考标准，ＥＤ－ＰＣＲ法敏感性为９５．５％，特异性为９６．３％。结论ＥＤ－ＰＣＲ法与其它３种方法相比，具有简便、快速、敏感性高、特异性强等优点     

RAS基因及表达产物P_(21)在妇科肿瘤中的研究进展

Ｐ２１系由原癌基因ＲＡＳ家族（Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ）所编码的一种蛋白质，其分子量为２１ＫＤ，是细胞周期中重要的调控因子。当ＲＡＳ基因发生突变时，可以导致原癌基因激活，使Ｐ２１异常表达，参与肿瘤的发生和发展。本文就ＲＡＳ基因及其表达产物Ｐ２１在妇科肿瘤中的研究进展作一综述。