三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴度测定及整合检测

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力 ,本实验使用 Wizard TMDNA纯化系统对构建成功的三种反义 c- myc逆转录病毒表达载体进行了纯化 ,并经脂质体介导包装 PA317细胞 ,使用 NIH 3T3细胞测定了 PA317抗性细胞克隆的病毒滴度 ,用 neo基因 PCR扩增检测外源基因的整合情况。结果显示纯化后的DNA达到了真核细胞转染的要求 ,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、 PA317抽样量的高度影响 ,而neo基因 PCR检测是一种敏感、经济和可靠的基因整合检测法     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础     

携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系.方法:质粒pet32-CIB经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒谪度测定.结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574 bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中；建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81 ×105 CFU/mL.结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系.     

逆转录病毒介导DNA修复蛋白在人骨髓细胞中的表达和抗性研究

目的增强造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因的特性和在造血细胞保护性基因治疗中的作用和意义.方法应用RT-PCR从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT,应用脂质体LipofectAMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,以BCNU加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染K562细胞和人造血细胞.应用PCR,Southernblot,RT-PCR,Westernblot及MTT法检测人MGMT基因在细胞中的转移和表达.结果酶切鉴定及DNA测序证实其MGMTcDNA克隆的正确性,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达8.6×106CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在K562细胞及人造血细胞中获得有效转移和表达.结论MGMT耐药基因的成功克隆并导入骨髓造血细胞且获高效表达对开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础.     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴工测定及整合检测

<正> 为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力,本实验使用Wizard~(TM)DNA纯化系统对构建成功的三种反义c-myc逆转录病毒表达载体进行了纯化,并经脂质体介导包装PA317细胞,使用NIH3T3细胞测定了PA317抗生细胞克隆的病毒滴度,用neo基因PCR扩增检测外源基因的整合情况.结果显示:1.纯化后的DNA260mm和280nm的OD值均大于1.8,且在琼脂脂糖电泳电中未有明显的RNA出现,说明DNA达到了真核细胞转染的要求,经灭菌和浓度调整后即可用于细胞转染.2.经测定,PA317的病毒滴度达到10~4级,这主要是因为病毒的感染效率不仅直接受病毒载体类型的影响,而且其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、PA317抽样量的高度影响.3.目的基因整合的检测;在所有抽取的转基因克隆细胞的基因组DNA中均能扩增出一条特异的、长430bp的neo基因片断电泳条带,而未转染组则无此条带.在检测基因转染后是否发生了染色体整合上,可用用Southem杂     

重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达

目的 探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装。方法 在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元，制备重组逆转录病毒后分别用以感染Hep G2和2．2．15细胞，免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达，PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 在包装细胞系PA317中能形成较高滴度的重组逆转录病毒，用以感染Hep G2细胞后，可检出核心抗原的表达。感染2．2．15细胞后，在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达，并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下，发挥HBV载体的功能，可望用于抗HBV基因治疗。     

人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。     

pLXSN—EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C。为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98％的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30．7％细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化：使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。     

胶质瘤的白细胞介素-4免疫基因治疗实验研究

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。本研究通过逆转录病毒载体将白细胞介素 4 (IL 4 )基因导入逆转录病毒包装细胞 ,注入到脑内荷瘤大鼠肿瘤组织中 ,观察其对胶质瘤的治疗作用。首先构建和鉴定携带IL 4基因的逆转录病毒载体Pbabe IL 4 ,将其导入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G4 18抗性筛选 ,得到携带目的基因的包装细胞 ;应用NIH3T3细胞测定抗性细胞克隆上清的病毒滴度 ,扩增培养高滴度产毒细胞克隆 ,命名为PA317IL 4 ;常规提取PA317IL 4细胞基因组总RNA ,通过RTPCR鉴定IL 4基因的整合 ;ELISA法检测PA317IL 4细胞培养上清的I…     

EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因, 并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A, 转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株.方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中, 与两辅助病毒载体PHIT456、 PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T, 测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929, 经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况.结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108 cfu/L, 感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A.结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础, 也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路.     

hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建携带人Trx(硫氧还蛋白 )基因的逆转录病毒载体。方法 :用DNA重组技术 ,将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN ,用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定。以磷酸钙转染法 ,将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317,并用G4 18筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度。结果 :构建了重组逆转录病毒载体 ,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切 ,电泳出现两个条带 ,分别为 0 .3kb和 5 .9kb。转染细胞上清中病毒滴度为 5 .5× 10 9cfu/L。提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功。结论 :携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础     

猪FasL基因在猪软骨细胞上的表达和鉴定

目的: 实现猪Fas配体(FasL)基因在猪软骨细胞中表达和鉴定。方法: 用RT- PCR扩增猪FasL基因片段, 构建重组pGCEN-FasL逆转录病毒载体, 并转染PA317细胞。经G418筛选获得高滴度的病毒液, 感染猪软骨细胞, 应用FACS和Westernblot检测软骨细胞上FasL的表达。结果: 经酶切分析、测序证明, 成功地构建pGCEN- FasL逆转录病毒载体。转染的软骨细胞表面FasL的表达率为 57%。Westernblot显示, 在Mr为 37 000处有 1条特异性蛋白带, 具有诱导Fas 细胞凋亡的作用。结论: 成功地构建重组猪FasL基因的逆转录病毒载体, 并在转染的软骨细胞上高表达具有生物学活性的FasL, 为建立同种异体软骨细胞移植的免疫耐受提供了实验依据。     

含人组织型纤溶酶原激活剂cDNA重组逆转录病毒的制备…

A recombinant retroviral vector containing tissue-type plasminogen activator (t-PA) cDNA was constructed and transfected into PA317 viral packaging cells, forming intact virus particles. Under electron microscope the recombinant retroviral particles were composed of envelope, capsid and core. These viral particles were spherical with a diameter of 90-180nm, and spread dispersely in the cells. NIH3T3 cell infected by retrovirus particles were screened with G418. The virus titer of 6 x 10(8) CFU/L was verified by counting the positive clones two weeks after screening. The expression of t-PA was demonstrated in the NIH3T3 cells infected with the recombinant virus.     

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

表达反义c-myc RNA的重组逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的逆转作用

为研究表达反义c－mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理，利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c－mycRNA的质粒，经病毒包装细胞PA317包装后，使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC－2细胞，经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC－2细胞中均有病毒的高表达，体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC－2细胞中有高表达的反义c－mycRNA，而内源性c－mycRNA的表达明显受抑；Westernblot分析发现c－myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c－mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明：表达反义c－mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

目的:构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,并与传统的逆转录病毒载体系统做比较。方法:首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上,构建携带内部核糖体进入位点(IRES)基因的逆转录病毒载体pC-MMP-IRES-GFP。将嵌合T细胞受体基因插入该载体中,与另外两个辅助载体pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T。48h后收培养上清,高速离心病毒。同时将嵌合T细胞受体基因插入传统的逆转录病毒载体pLXSN中,并转染包装细胞PA317,用G418加压筛选出转染的PA317细胞克隆。扩大培养48h后,收细胞培养上清即为病毒液,分别用上述两种方法得到的病毒液感染NIH3T3细胞,检测病毒的滴度。取适量病毒液感染用PHA激活后的人原代T细胞,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光,并用流式细胞术(FCM)检测病毒感染的效率。结果:成功地构建逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP。将目的基因插入该载体中,与pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T。培养48h后,离心收获浓缩的上清中含有滴度为2.15×1011VP/L的病毒。以其感染用PHA激活后的人原代T细胞48h后,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。FCM检测病毒对T细胞的感染效率为50%~60%,并可用FCM进行分选。而用pLXSN载体转染的PA317细胞,包装得到的病毒滴度为6.43×109VP/L,病毒感染T细胞的效率仅为5%~10%。结论:构建了能高效转染T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,为T细胞的基础与临床研究打下了基础。     

HBV-S基因逆转录病毒重组载体的构建及其在抗原提呈细胞中的表达

目的: 为探索逆转录病毒载体在免疫细胞中的表达和基因治疗中的应用。方法:用DNA重组技术构建乙肝病毒表面抗原C(HBV-S)基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染PA317后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染 HepG₂、巨噬细胞 (RAW264.7)和EL₄细胞,分别用RT-PCR及ELISA法检测目的基因表达。结果:HBsAg在上述细胞中获得不同程度的表达,48 h细胞上清中HBsAg含量(A值)分别为0.92、0.53、0.42。结论:本实验所用载体,其目的基因可 在细胞内稳定表达,而且,在巨噬细胞等抗原提呈细胞中均有较高的表达,这提示我们质粒免疫有可能通过刺激巨噬细胞诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。作为一种高效的基因转移系统,该表达系统可用于基因免疫和基因治疗。     

小鼠IL-3 cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠IL-3基因治疗可能性,本文作者将小鼠IL-3cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系PA317,经新霉素类抗菌素G418选择,得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复制缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化NIH3T3细胞,得到了数个自发分泌IL-3的克隆。在去掉G418,传代15代,约2个月后,这些克隆分泌IL-3的能力没有明显的变化。