5-氮杂-2’-脱氧胞苷对舌癌细胞株SCC-4细胞RECK基因甲基化水平及侵袭的影响

目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-Dc) 对舌癌细胞株SCC-4中抑癌基因RECK基因甲基化水平及侵袭能力的影响。方法 用不同浓度的5-aza-Dc处理舌癌细胞株SCC-4,72 h后,以甲基化特异性PCR（MSP）检测SCC-4细胞RECK基因的甲基化状态,实时定量 PCR技术检测SCC-4细胞RECK基因mRNA的表达,Western 印迹检测蛋白质表达,Transwell体外侵袭实验检测侵袭能力。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 MSP检测未处理组细胞RECK基因呈高甲基化状态,经5-aza-dC处理后甲基化得到逆转。实时定量 PCR检测显示,不同浓度5-aza-dC处理SCC-4细胞72 h后, 相对mRNA表达随着药物浓度增加而增加(P<0.05)。Western 印记分析结果显示,不同浓度5-aza-dC组的RECK蛋白表达相对水平随药物浓度增加而增加,SCC-4细胞的侵袭力随药物浓度增加而降低。结论 5-aza-dC可逆转舌癌SCC-4细胞中RECK基因的高甲基化状态,并恢复RECK基因mRNA及蛋白的表达,降低其体外侵袭能力。     

DNMT1干扰对唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M E-cadherin表达的影响

目的：建立DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达稳定抑制的唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M,探讨DNMT1表达抑制对ACC-M细胞E-cadherin表达的影响。方法：设计靶向干扰DNMT1的shRNA序列,构建携带该序列的慢病毒载体并转导ACC-M细胞,对筛选出的抗性克隆采用RT-PCR、荧光定量PCR、免疫印迹方法分别检测DNMT1mRNA、蛋白质水平,筛选获得DNMT1表达稳定抑制的ACC-M细胞,并通过甲基化特异性PCR检测E-cadherin基因启动子的甲基化状态,荧光定量PCR检测E-cadherin的表达情况。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：筛选获得DNMT1稳定表达抑制的ACC-M细胞,其mRNA、蛋白相对表达水平（0.156±0.008,0.163±0.013）显著低于空白对照组和空载对照组。进一步检测发现,E-cadherin基因启动子甲基化水平明显降低,E-cadherinmRNA表达水平显著增高,P〈0.05。结论：shRNA慢病毒载体介导的RNA干扰能够有效、稳定地抑制ACC-M细胞DNMT1的表达,并降低ACC-M细胞E-cadherin基因启动子的甲基化水平,从而使E-cadherin基因表达增强。     

RNA干扰Survivin对腺样囊性癌细胞株ACC-M生长的抑制作用

目的:探讨RNA干扰Survivin基因对腺样囊性癌细胞生长的抑制效应.方法:设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-M细胞株.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)、Western-blot法分别检测转染后的ACC-M细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,结果:测序证实真核表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-Survivin的ACCM细胞株中,Survivin mRNA及蛋白表达明显降低,ACC-M细胞生长受到抑制.结论:pGenesil-shRNA-Survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞生长.     

5-氮-2′-脱氧胞苷选择性上调癌-睾丸抗原在腺样囊性癌细胞系的表达

目的：探讨5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,5DC）对癌-睾丸抗原（cancer-testis anti-gens,CTAs）在腺样囊性癌细胞株ACC-2（低转移株）和ACC-M（高转移株）中表达的调节作用。方法：采用RT-PCR检测5DC处理后6种癌-睾丸抗原（MAGE-1,MAGE-C2,NY-ESO-1,SCP-1,KU-CT-1,SLLP-1）在ACC-2和ACC-M中的表达情况;采用免疫细胞化学染色观察其中3种抗原在蛋白水平的表达。结果：RT-PCR显示：正常对照组,MAGE-1和MAGE-C2在ACC-2和ACC-M中均表达,而NY-ESO-1仅在ACC-M中表达。不同浓度的5DC处理后,MAGE-1、MAGE-C2在ACC-2和ACC-M中的表达增强（P〈0.05）;NY-ESO-1表达无明显改变。免疫细胞化学结果显示：5DC处理后,MAGE-1和MAGE-C2在两个细胞系的表达增强。结论：5DC可选择性增强MAGE-1和MAGE-C2在ACC-2和ACC-M的表达,提示MAGE-1和MAGE-C2可作为腺样囊性癌的潜在靶向抗原。     

沉默DNA结合抑制蛋白-1基因对腺样囊性癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的 探讨DNA结合抑制蛋白-1(Id-1)基因在腺样囊性癌细胞生长和侵袭行为中的作用.方法以涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M和ACC-2为研究对象,免疫荧光检测Id-1基因的表达;用小干扰RNA进行Id-1基因的RNA干扰:于干扰前后应用RT-PCR和Western blot检测2个细胞系Id-1表达情况:于干扰前后应...     

涎腺腺样囊性癌细胞系中DNA甲基化研究

目的探讨涎腺腺样囊性癌（adenoidcysticcarcinoma，ACC）细胞系中抑癌基因甲基化状况及其与mRNA、蛋白表达之间的关系。方法甲基化特异性PCR法检测ACC细胞系ACC-2、ACC-3、ACC-M中E-钙黏着蛋白（E-cadherin，E-cad）、p16、RASSFlA、DAPK、MGMT基因启动子区的甲基化状况。应用RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测E-cad、p16在mRNA和蛋白水平的表达。结果3个ACC细胞系中均检测到E-cad、p16基因的甲基化，而没有RASSFlA、DAPK、MGMT基因的甲基化；mRNA和蛋白水平均未检测到E-cad的表达，均检测到p16的表达。结论ACC细胞系中，E-cad、p16基因启动子区的甲基化是常见事件，甲基化可能是E-cad基因失活的主要机制之一。     

基质金属蛋白酶-1在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在人涎腺腺样囊性癌不同转移力细胞系中的表达。方法:以人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞系及其高转移株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型,采用免疫组化法和蛋白印迹(Western blot)法检测MMP-1的蛋白表达水平。结果:MMP-1在ACC-M细胞中的表达水平高于ACC-2细胞。结论:MMP-1在人涎腺腺样囊性癌的侵袭转移过程中可能发挥作用。     

TIP30蛋白在涎腺腺样囊性癌高转移细胞中的表达鉴定及作用

目的筛选含有Tip30的涎腺腺样囊性癌高转移细胞，检测TIP30蛋白在涎腺腺样囊性癌高转移细胞中的表达，检测携带外源性TIP30细胞的细胞周期分布变化。方法应用脂质体转染方法将TIP30导入ACC-M细胞中，G418筛选阳性克隆，用免疫印记杂交法(Western blot)检测转染细胞中TIP30蛋白的表达；流式细胞仪测定细胞周期分布。结果筛选14天后，含有TIP30的ACC-M单克隆形成，TIP30蛋白在ACC-M中表达稳定；携带外源性TIP30的细胞G0-G1期比例增高，G2-M、S期细胞比例降低。结论ACC-M细胞能稳定表达外源基因TIP30，携带外源性TIP30的细胞G0-G1期细胞比例增高，G2-M、S期细胞比例降低，从而影响ACC-M细胞的生长，是TIP30抑制涎腺腺样囊性癌细胞生长的可能机制之一。     

过表达RECK基因对成釉细胞瘤hTERT＋_AM永生化细胞株MMPs表达及侵袭能力的影响

目的：观察转染RECK基因对人成釉细胞瘤（ameloblastoma,AM）细胞株hTERT-AM的MMPs表达及细胞侵袭力的影响。方法：利用RECK基因慢病毒载体Lenti—RECK—eGFP／puro转染hTERTAM细胞株．Puro筛选和镜下挑单克隆纯化细胞。CCK8检测细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,qRT—PCR检测细胞中RECK的mRNA的表达情况。Western蛋白印迹检测细胞中RECK、MMP2、MMP9的表达情况。采用SPSS13．0软件包对数据进行统计学分析。结果：转染RECK基因后,hTERT~AM细胞中RECK的mRNA和蛋白的表达均显著增高（P均〈0．01）,细胞活性无显著变化（P均〉0．05）,细胞迁移、侵袭能力均显著下降（P均〈0．01）,MMP2、MMP9蛋白表达均显著下降（P均〈0．05）。结论：RECK基因参与人成釉细胞瘤局部侵袭的调节,过表达RECK基因后,MMP2、MMP9下调,抑制AM细胞迁移和侵袭。RECK有望成为人成釉细胞瘤侵袭防治的新靶点。     

DNApolβ启动子和CMV启动子调控的p53基因在涎腺腺样囊性癌细胞中表达的比较

目的检测DNA polβ启动子在涎腺腺样囊性癌细胞中的活性，探讨DNA polβ启动子对外源性野生型p53基因表达的影响。方法荧光素酶法测定DNA polβ启动子在涎腺腺样囊性癌细胞中的活性。构建携带人野生型p53基因的真核表达载体，以脂质体法转染涎腺腺样囊性癌SACC- 83细胞，逆转录聚合酶链反应（RT- PCR）检测p53基因mRNA的表达。博莱霉素、H2O2及紫外线刺激转染细胞，采用RT- PCR及Western blot法比较DNA损伤下DNA polβ启动子和CMV启动子调控的p53基因及P53蛋白的表达。结果荧光素酶活性分析显示，涎腺腺样囊性癌细胞中DNApolβ启动子活性增高。p53基因的导入使其在涎腺腺样囊性癌细胞中表达增强，DNA polβ启动子组较CMV启动子组更为明显。DNA损伤后，DNA polβ启动子组的p53基因和P53蛋白的表达较CMV启动子组增强（P<0.05）。结论在涎腺腺样囊性癌SACC- 83细胞中，DNA polβ启动子的活性增高，DNA polβ启动子能够增强外源性野生型p53基因在涎腺腺样囊性癌细胞中的表达。     

miR-181a抑制唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移机制的实验研究

目的 探讨miR-181a在唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭、转移中的作用。方法 利用QRT-PCR检测miR-181a在一对不同侵袭、迁移能力细胞株中的表达水平。过表达或沉默miR-181a在SACC-LM和SACC-83细胞中的表达。利用激光共聚焦显微镜观察转染后细胞骨架的改变。Western免疫印迹检测转染后侵袭、转移相关因子的表达。通过尾静脉注射miR-181a mimics和mimics NC细胞,建立裸鼠肺转移模型。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果 QRT-PCR结果显示,miR-181a在低侵袭、迁移能力SACC-83细胞中的表达量显著高于高侵袭、迁移能力的SACC-LM细胞。SACC-LM细胞转染miR-181a mimics后,细胞呈梭形,Slug、pERK1/2、ERK1/2表达水平下调;SACC-83细胞转染miR-181a LNA后,细胞变圆,体积变小,Slug、pERK1/2、ERK1/2表达水平升高。裸鼠肺转移模型miR-181a mimics组,细胞形成肺转移灶面积显著小于mimics NC组（P<0.05）。结论 miR-181a能抑制SACC的侵袭和转移。     

miR-181a对唾液腺腺样囊性癌细胞株侵袭和迁移的影响

目的研究与唾液腺腺样囊性癌（SACC）侵袭转移相关的微小RNA（miRNA）,探讨miR-181a对SACC侵袭和迁移的影响。方法选择1对不同侵袭迁移能力的SACC细胞株（SACC-LM/SACC-83）,采用miRNA芯片技术分析细胞株中miRNA的表达差异,初步筛选出与SACC侵袭转移相关的miRNA。再通过过表达或沉默细胞株中miR-181a的表达,进行细胞划痕和Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭、迁移能力。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理,以P〈0.05为差异具有统计学意义。结果 miRNA芯片结果显示,高侵袭迁移能力的SACC细胞株miR-181a表达明显下降。细胞划痕和Transwell实验结果表明,SACC-LM细胞转染miR-181a mimics后体外侵袭迁移能力明显受到抑制（t=-5.235,P〈0.05）;SACC-83细胞转染miR-181a LNA后体外侵袭迁移能力有所提高（t=7.713,P〈0.05）。结论不同侵袭迁移能力的SACC细胞株中存在多种miRNA的差异表达。miR-181a的表达降低可能导致SACC细胞侵袭迁移能力的增强。     

地西他滨上调唾液腺腺样囊性癌细胞系细胞hMLHl的表达

目的：通过检测地西他滨（decitabine）对体外培养人唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cvstic carcinoma,SACC）细胞系细胞hMLHl的影响．探讨DNA甲基化转移酶抑制剂应用于SACC治疗的可行性及可能机制。方法：采用不同浓度的decitabine处理SACC细胞系SACC-83和SACC—LM细胞．观察细胞形态变化。选取5Ixmol／L的decitabine处理细胞后,分别使用甲基化特异性PCR、蛋白免疫印迹法、流式细胞技术检测用药前、后hMLHl基因启动子甲基化状况、hMLHl蛋白表达和细胞周期、凋亡的变化。应用SPSSl3．0软件包对数据进行独立样本t检验。结果：经decitabine处理后,SACC-83和SACC—LM细胞中hMLHl基因启动子甲基化水平降低,hMLHl蛋白表达水平分别升高1．582倍和1．977倍（P〈0．05）。用药后G0／G1期细胞比例显著减少．S期细胞比例显著增加（P〈0．05）．2种细胞系细胞晚期凋亡比例显著增加,差别有统计学意义（P〈O．05）。结论：DeCitabine可通过改变hMLHl基因启动子甲基化水平,上调蛋白表达;使SACC细胞阻滞于S期,Decitabine有可能作为SACC化疗药物或与顺铂联合使用,增强顺铂的效果．     

唾液腺腺样囊性癌细胞系中5个抑癌基因甲基化及其表达

目的：探讨唾液腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma,ACC）细胞系中CDH13、RASSF2A、TFPI-2、hMLH-1、MyoD1基因的甲基化及其与mRNA表达之间的关系。方法：甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）法检测ACC细胞系ACC-2、ACC-3、ACC—M中CDH13、RASSF2A、TFPI-2、hMLH—1、MyoD1基因的甲基化：RT—PCR及荧光实时定量PCR对存在甲基化的基因进行mRNA水平的检测。结果：3个细胞系中均存在CDH13、RASSF2A、TFPI-2基因的甲基化和未甲基化,只存在MyoD1基因的甲基化和hMLH-1基因的未甲基化：ACC-2中CDH13基因mRNA水平的表达显著高于ACC—M,ACC-3中RASSF2A的表达显著高于ACC-2、ACC—M,3个细胞系中均未检测到MyoD1基因的表达。结论：ACC细胞系中,CDH13、RASSF2A、TFPI-2、MyoD1基因的甲基化为常见事件,甲基化可能为MvoD1基因失活的主要机制．CDH13基因的表达可能与ACC的转移相关．     

NDRG2对唾液腺腺样囊性癌增殖、侵袭的影响

目的:探讨NDRG2基因在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及其对SACC-LM细胞增殖、侵袭的影响。方法:采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析唾液腺腺样囊性癌组织及癌旁组织样本中NDRG2的表达,采用RNA干扰技术降低腺样囊性癌细胞SACC-LM中NDRG2基因的表达,利用CCK-8实验及集落形成实验检测细胞增殖能力的变化,利用划痕实验及Transwell实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化,利用Western 免疫印迹实验检测侵袭标志蛋白以及上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的表达。采用SPSS 17.0软件包进行数据处理。结果:NDRG2基因在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达低于癌旁组织（P=0.017）。在降低NDRG2基因的表达后,SACC-LM细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著增强（P<0.05）,侵袭标志蛋白MMP2表达量显著升高（P=0.0004）,上皮标志物E-Caherin表达量显著降低（P=0.0229）,间充质标志物N-Cadherin表达量显著升高（P=0.0009）。结论:NDRG2基因在腺样囊性癌中低表达,降低NDRG2的表达可增强SACC-LM的增殖、迁移及侵袭能力。     

干扰细胞信号转导抑制因子1表达对人口腔癌细胞生物学功能的影响

目的：研究细胞信号转导抑制因子1（SOCS1）基因对人口腔癌细胞增殖、周期及体外侵袭生物学功能的影响。方法：Western blotting及实时定量PCR验证人口腔癌细胞系KB中基因SOCS1的干扰效果;MTT法检测细胞增殖;应用Transwell侵袭小室模型观察口腔癌细胞的侵袭能力;流式细胞术分析细胞周期的分布情况。结果：SOCS1干扰片段显著降低口腔癌KB细胞SOCS1基因的mRNA及蛋白表达水平。抑制SOCS1表达后,细胞体外侵袭能力明显下降（P<0.05）,且转染72 h后KB细胞数量较对照组显著减少（P<0.05）;干扰KB细胞SOCS1基因表达,使G0/G1期细胞数目明显多于对照组（P<0.05）,而S、G2/M期细胞数目显著少于对照组（均P<0.05）。结论：干扰人口腔癌细胞株KB中的SOCS1基因表达后,KB细胞增殖、体外侵袭能力减弱,细胞分裂受到抑制。     

The effect of proteoglycans inhibited on the neurotropic growth of salivary adenoid cystic carcinoma

J Oral Pathol Med (2010) 40 : 476–482 Objective: To evaluate the relationship between inhibition of proteoglycans which secreted by salivary adenoid cystic carcinoma cell line (SACC‐83) and the neurotropic ability of the tumor cells. Methods: The expression vector of short hairpin RNA (shRNA‐WJ4) targeting xylosyltransferase‐I gene was constructed and transfected into SACC‐83 cells (group SACC83‐WJ4), shRNA‐HK used as negative control was transfected into SACC‐83 cells (group SACC‐83‐HK), SACC‐83 cells without transfection was used as black control (group SACC‐83). The xylosyltransferase‐I gene expression was measured by real‐time PCR. The content of proteoglycans was detected by Blyscan Assay Kit. The effect of down‐regulated proteoglycans on the perineural invasion of nude mice was observed. All data were analyzed by the software spss 13.0. Results: The results showed that the transfected efficiency of shRNA was 43.3%. The expression of xylosyltransferase‐I was inhibited by 43.0% 48 h after transfection of shRNA‐WJ4. The content of proteoglycans was down‐regulated by 30.25% 48 h after transfection. In the neurotropic experiment in vivo of nude mice, the rate of perineural invasion of group SACC‐83‐WJ4 was 33.33%, significantly lower than that of the negative control (100%) and the black control (100%) (P < 0.05). Conclusion: Xylosyltransferase‐I gene of SACC cells was silenced by RNA interference technology, proteoglycans secretion was reduced and neurotropic invasion behavior of SACC was inhibited obviously.