组蛋白去甲基化酶KDM4B促进根尖牙乳头干细胞中成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶KDM4B对根尖牙乳头干细胞定向分化能力的影响.方法 人重组骨形成蛋白4(BMP4)刺激根尖牙乳头干细胞后检测KDM4B的表达;利用慢病毒转染过表达或者基因敲除KDM4B进行获得性或丧失性功能研究.通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、钙离子定量分析研究根尖牙乳头干细胞体外成骨和成牙本质分化能力.结果 BMP4促进根尖牙乳头干细胞KDM4B的表达.基因敲除KDM4B抑制根尖牙乳头干细胞ALP活性及体外矿化能力、促进转录因子PPAR-gamma的表达.过表达KDM4B增强根尖牙乳头干细胞ALP活性和体外矿化能力.结论 组蛋白去甲基化酶KDM4B具有促进根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

CD24基因调控根尖牙乳头干细胞的成骨分化功能

目的 研究干细胞表面标记CD24基因对根尖牙乳头干细胞成骨分化能力的影响。方法 利用CD24 shRNA基因敲除CD24进行丧失性功能研究;实时定量RT-PCR检测CD24的基因敲除效果;通过ALP活性检测、茜素红染色及钙离子定量分析明确根尖牙乳头干细胞体外成骨分化能力的变化;实时荧光定量RT-PCR检测成骨分化相关基因-I型胶原蛋白1A、I型胶原蛋白1B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和成骨相关转录因子RUNX2的表达分析研究根尖牙乳头干细胞基因表达改变。结果 实时定量RT-PCR结果显示CD24可以在根尖牙乳头干细胞有效的被敲除;碱性磷酸酶活性结果显示敲除CD24抑制根尖牙乳头干细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示敲除CD24明显抑制根尖牙乳头干细胞体外矿化能力;实时定量RT-PCR结果显示敲除CD24明显抑制I型胶原蛋白A、型胶原蛋白B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和RUNX2的表达。结论 基因沉默CD24可以通过抑制转录因子RUNX2及成骨分化基因的表达,从而抑制根尖牙乳头干细胞体外成骨分化功能。     

雌激素受体α高表达慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙/成骨分化的影响

目的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)高表达慢病毒载体感染根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs),探讨其在SCAPs体外成牙/成骨分化中的作用。方法 ERα高表达慢病毒载体感染SCAPs,Western blot检测ERα的表达,茜素红染色和Western blot检测其对SCAPs成牙/成骨分化的影响。结果体外实验表明,实验组(ERα)ERα的蛋白表达水平较对照组(GFP)明显升高,实验组成牙/成骨向分化标志蛋白(碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和骨钙素(osteocalcin,OCN))表达水平在3d或7d的表达均有不同程度上调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。在成骨诱导条件下,实验组(ERα)的矿化结节形成量较对照组(GFP)多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的ERα高表达载体成功在体外上调了目的基因的表达,并促进根尖牙乳头干细胞的成牙/成骨分化。     

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化

目的：研究B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子（BCL6co—repressor,BCOR）对根尖牙乳头干细胞成肌分化能力的影响。方法：利用HA—BCOR逆转录病毒载体过表达BCOR进行获得性功能研究;WesternBlot检测HA—BCOR的过表达效果;重组人肿瘤生长因子β1（TGF—β1）蛋白诱导根尖牙乳头干细胞体外成肌分化;通过检测成肌分化相关基因smoothened（SMO）、smoothmuscleactinalpha2（ACTA2）和caldeson（CALDl）的表达研究根尖牙乳头干细胞体外成肌分化能力。结果：WesternBlot结果显示HA-BCOR可以在根尖牙乳头干细胞有效的过表达;过表达BCOR抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化相关基因SMO和CALDl的表达。结论：过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞体外成肌分化,证实BCOR是根尖牙乳头干细胞成肌分化的抑制甚因。     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

NFκB信号通路在炎症根尖牙乳头干细胞中的作用

目的研究NFκB信号通路在炎症条件下对根尖牙乳头干细胞的作用。方法利用TNFα和Ecoli.LPS刺激人根尖牙乳头干细胞。Western Blot检测IκBα的磷酸化及蛋白降解,采用Real-time PCR在mRNA水平检测IL6及IL8的表达。结果 10 ng/ml TNFα或500ng/ml Ecoli.LPS能诱导IκBα磷酸化及蛋白降解,并且促进NFκB的下游基因IL6及IL8的表达。结论在炎症根尖牙乳头干细胞,TNFα或LPS可以通过IκK复合体激活NFκB信号通路。NFκB信号通路的活化可能是导致炎症状态下根尖牙乳头干细胞功能损害的重要因素。     

Vitapex对根尖牙乳头干细胞成牙/骨向分化及自噬的影响

目的:研究Vitapex糊剂对根尖牙乳头干细胞(SCAPs)成牙/骨向分化的影响,初步讨论其潜在机制。方法:酶消化法分离并培养SCAPs;制备不同浓度Vitapex条件培养基,通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定选取最适浓度;ALP染色、实时荧光定量PCR和Western blot检测成牙/骨向相关基因和蛋白的变化情况;Western blot检测自噬相关蛋白表达水平。结果:0.2 g/L Vitapex条件培养基组ALP活性最高,选取为最适浓度进行后续实验。与对照组比较,该浓度Vitapex条件培养基能显著促进SCAPs细胞ALP、核心结合蛋白因子2(RUNX2)、成骨相关转录因子(OSX)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因和蛋白表达(P<0.05)。同时,0.2 g/L Vitapex组中微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论:Vitapex可促进SCAPs成牙/骨向分化,并激活自噬。     

根尖牙乳头干细胞和人脐静脉血管内皮细胞联合培养对牙髓组织成血管能力的影响

目的 探讨联合培养根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAPs）和人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）对牙髓组织血管形成能力的影响。方法 分别使用α-MEM培养基和成骨、成脂、成神经诱导培养基处理SCAPs,采用油红O染色、茜素红染色、βIII-Tubulin免疫荧光染色,分别检测SCAPs的成脂、成骨和神经向分化能力。取单独SCAPs、HUVECs细胞以及联合培养SCAPs和HUVECs细胞进行小管形成实验,分别在3、6、9 h检测各组小管形成的长度、节点数目和结合区面积。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 染色结果显示,实验组SCAPs形成了更多的矿化结节、红色脂滴和神经样细胞。小管形成实验结果表明,联合培养组细胞可以更快地形成类血管状结构,差异显著。结论 SCAPs具有成骨、成脂和神经向诱导分化能力,联合培养SCAPs和HUVECs可以加速血管结构的形成。     

Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞牙/骨向分化的影响

目的 探讨Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, SCAPs)的牙/骨向分化的影响。方法 分离培养SCAPs,流式细胞术对SCAPs进行表面分子鉴定,检测Tideglusib对SCAPs细胞增殖是否有影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和ALP染色筛选Tideglusib促进SCAPs表达ALP活性的最佳浓度。用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)模拟炎性微环境刺激SCAPs。采用Western blot及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)和基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)表达变化。结果 CCK-8实验显示：Tideglusib浓度低于50 nmol/L时对细胞增殖无抑制作用;1 nmol/L Tideglusib处理LPS刺...     

miR-199a调控IGF1表达对机械刺激下成骨细胞分化的影响

目的： 探讨微小RNA（miR）-199a在机械牵张力刺激下MC3T3-E1细胞中的表达变化及其对牵张力刺激MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制。方法： 对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12%牵张力0、3、6、12和24 h后,利用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP活性,实时荧光定量PCR检测骨钙素（OCN）、成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、Runt相关转录因子2（Runx2） mRNA和miR-199a的表达。将MC3T3-E1细胞分为对照组、牵张力组、牵张力+miR-NC组和牵张力+miR-199a组,加载12%牵张力和转染miR-199a模拟物后,观察miR-199a和OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达以及ALP活性。茜素红S（ARS）染色观察钙结节形成能力。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a与胰岛素样生长因子1（IGF1）的靶向关系,实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测miR-199a模拟物对IGF1 mRNA和蛋白表达的影响。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 与0 h时间点相比,以机械牵张力刺激3、6、12和24 h后,MC3T3-E1细胞ALP活性和OCN、OSX、Runx2 mRNA表达水平均显著升高,而miR-199a表达水平显著降低（P<0.05）,12 h时变化最为显著。与对照组相比,牵张力组细胞中miR-199a表达水平显著降低,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著升高（P<0.05）;与牵张力组相比,牵张力+miR-NC组细胞中上述各指标差异均无统计学意义（P>0.05）;与牵张力+miR-NC组相比,牵张力+miR-199a组细胞中miR-199a表达水平显著升高,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著降低（P<0.05）。miR-199a可与IGF1靶向结合,miR-199a模拟物可使MC3T3-E1细胞中IGF1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论： miR-199a可抑制机械牵张力刺激诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化,其作用机制可能与靶向调控IGF1表达有关。     

甲状旁腺素对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响.方法:根据PTH应用方式不同分为3组:PTH持续应用组、PTH间歇应用组、空白对照组.用茜素红染色检测培养6 d和14 d后,各组细胞矿化结节的形成情况;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨分化、骨形成相关蛋白和基因mRNA.结果:PTH间歇应用组在6 d和14 d时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在3组中数量最少.经过6 d和14 d的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性,RUNX2、BSP和MMP13蛋白,成骨分化标志物RUNX2,ALP和骨形成相关基因OCN及OSX的表达,均明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05).PTH持续应用组COL2a1的mRNA及成骨抑制基因SOST mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05).结论:间歇性应用PTH可明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,而持续性应用PTH则抑制该过程.     

钛表面形貌和亲水性表面对成骨细胞增殖、分化的影响

目的:通过体外实验研究普通喷砂酸蚀纯钛表面和亲水性喷砂酸蚀纯钛表面对成骨细胞增殖、分化等生物学行为的影响。方法:纯钛片表面分别采用光滑处理(smooth pretreated Ti,PT)、大颗粒喷砂酸蚀表面处理(sand-blasted,large-grit,acid-etched,SLA)及亲水性化学活化大颗粒喷砂酸蚀表面处理(chemically-modified SLA,modSLA/SLActive),在表面接种MC3T3-E1成骨细胞,采用MTT、碱性磷酸酶半定量测试以及茜素红染色检测其对成骨细胞增殖、分化的影响,并采用实时荧光定量PCR检测成骨细胞在不同材料表面骨功能基因表达的差异。应用SAS 9.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与光滑钛表面相比,普通喷砂酸蚀钛表面能通过促进ALP、钙基质的分泌和成骨功能基因(Runx2、OSX、OCN和OPN)的表达而显著抑制成骨细胞增殖并促进其分化。在表面粗糙度的基础上增加亲水性,可使这一效应更加明显。结论:表面粗糙度和亲水性是影响成骨细胞生物学行为的重要因素,粗糙钛表面能显著抑制成骨细胞增殖,促进其分化,亲水性的粗糙钛表面促进成骨细胞分化的作用更加显著。     

Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨

目的:探讨Runx2和Osterix (OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用.方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs.通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响.通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达.采用GraphPad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析.结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用.HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调.结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化.     

山奈酚通过mTORC1信号促进牵张力下小鼠骨髓间充质细胞成骨分化机制研究

目的探讨山奈酚(kaempferol,Kae)对周期性单轴牵张力下小鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mes?enchymal cells,BMMCs)成骨分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin com?plex 1,mTORC1)信号通路的作用。方法对体外分离培养的小鼠BMMCs施加形变量10%的单轴动态牵张力,通过细胞毒性试验筛选出合适浓度Kae,并添加工具药pp242改变内源性mTOR信号,在牵张后4 h利用化学比色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、ELISA法检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达量,流式细胞仪检测细胞内钙离子相对含量;利用Western Blot检测内源性mTORC1信号通路主要分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases,S6K)、4E/BP1的磷酸化表达及成骨转录因子Runx2和Osterix的表达变化,qRT?PCR检测上述因子mRNA表达水平。结果10μmol/L Kae对细胞的抑制作用较小,且成骨能力最强。加力结束后4 h,Kae能够有效促进BMMCs成骨分化,ALP表达为(153.04±18.72)U/mg,OCN表达为(1.64±0.25)U,成骨转录因子Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白水平表达上调,细胞内钙离子含量下降,同时mTORC1信号通路中mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调;在加入pp242抑制mTORC1信号表达后,mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,BMMCs成骨分化效应显著被抑制,Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白表达显著下调,ALP及OCN表达下调,细胞内钙离子含量增高。结论Kae通过mTORC1信号通路促进牵张力下小鼠BMMCs成骨分化。