两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较***

背景：人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点。 目的：寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法。 方法：取5~10周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定。 结果与结论：两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形。抗-细胞角蛋白7阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达。胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P < 0.05)。提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法。      

人早孕绒毛滋养层细胞原代培养:差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性

背景:国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用。目的:拟求建立一种人妊娠5～10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法。方法:采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5～10周人绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25～40min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度。结果与结论:倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1h后可见部分细胞贴壁,24h后70%～80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形。七八天长满瓶壁的80%～90%可传代。9～10d铺满培养瓶底部。细胞碎屑不贴壁。传代接种后1.5h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%～80%。采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞。     

从人胎盘中分离巨噬细胞的方法

目前从人胎盘组织中分离巨噬细胞的方法的不足之处是(1)获取的贴附细胞数量较少.(2)贴附细胞中的种类不单一.本文作者介绍了一种改良法.方法要点:首先将绒毛膜组织碎块置于含有胶原酶、胰酶、DNA酶的混合液中,经反复消化至凝胶状,然后加入分离液,得到有吞噬能力的胎盘细胞悬液.在CO_2培养箱内培养18小时,即可获取大量贴附细胞.作者采用酯酶染色法、吞噬能力测定法和应用抗单核细胞单克隆抗体进行玫瑰花结试验,来确定巨噬细胞     

低分子量肝素对滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响

目的:探讨低分子量肝素对体外培养人早孕绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响。方法:将经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化,通过Percoll细胞分离液纯化得到的绒毛滋养层细胞进行体外培养。采用不同浓度低分子量肝素干预培养24h后,ELISA法测定细胞上清液中MMP-2、TIMP-2的浓度;采用Tr-answell小室观察滋养层细胞的侵袭能力。结果:不同浓度的低分子量肝素(1.0×102IU/L,1.0×103IU/L,1.0×104IU/L)干预人早孕绒毛滋养层细胞后,与对照组相比,MMP-2的表达上调,滋养层细胞侵袭力增强,在1.0×103IU/L时MMP-2表达最高,滋养层细胞侵袭力最强(P0.05)。TIMP-2的表达随着低分子量肝素浓度的增加而逐渐下降,与对照组比较,在1.0×103IU/L、1.0×104IU/L组明显降低(P0.05),但1.0×103IU/L组与1.0×104IU/L组之间TIMP-2的表达无差异(P0.05)。结论:低分子量肝素可能直接通过影响绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2的表达进而影响绒毛滋养层细胞的侵袭能力。     

人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性

背景：胎盘间充质干细胞来源稳定,正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。 目的：比较从胎盘组织绒毛膜与绒毛滋养层分离获取人胎盘间充质干细胞生物学特性的差异。 方法：手术剪剥离人胎盘表面羊膜,分别剪取胎儿侧的绒毛膜与绒毛滋养层组织机械破碎后,分别加含Ⅱ型胶原酶的PBS消化液消化,分离为单个核细胞,用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度下培养,48 h后全量换液,去除非贴壁细胞,添加新鲜培养基,当细胞融合90%左右时,胰酶传代。通过观察原代细胞总数,细胞生长形态,以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从不同胎盘组织分离获得胎盘间充质干细胞的差异。 结果与结论：流式细胞仪测定结果显示,从绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞间充质干细胞表面标记CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上,两种来源的细胞生长都呈现典型的成纤维细胞形态,这表明绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞都具有间充质干细胞的特性。提示消化时间相同,酶浓度相同,以及摇床转速相同的情况下,可从绒毛膜中可以得到更多的细胞,对于后续培养更易获得较多的细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。     

绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离培养与鉴定

目的探索绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离和培养方法,并进行鉴定。方法采用胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养滋养层细胞,倒置相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点;应用常规HE染色和免疫组织化学染色,透射电镜技术进行绵羊多核绒毛膜滋养层细胞鉴定。结果倒置相差显微镜下,滋养层细胞为双核及多核细胞,细胞形态为上皮样,呈片状铺展生长;绵羊胎盘子叶与培养的滋养层细胞爬片的细胞角蛋白免疫组织化学染色均显示多核滋养层细胞胞质为棕色阳性信号,透射电镜可见滋养层细胞表面微绒毛发达,胞质内有较多膜包小泡及丰富的微丝和脂滴。结论建立了胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的方法,获得了较高纯度的具有生物学活性的多核绵羊绒毛膜滋养层细胞。     

绒毛细胞培养方法的比较及绒毛细胞核型分析在胚胎停育中的应用

目的探讨两种绒毛细胞培养方法对绒毛细胞培养结果的影响以及其染色体核型分析在胚胎停育中的应用。方法取103例胚胎停育的绒毛细胞分别采用胰酶与胶原酶混合消化法和组织块直接培养法进行细胞培养、染色体核型分析。结果 103例绒毛组织两种方法均培养成功98例,培养成功率为95.1%,胰酶与胶原酶混合消化法比组织块培养法培养时间更短。共分析绒毛标本98例,发现异常核型42例,异常率42.86%,其中数目异常最多(39例)。结论胰酶与胶原酶混合消化法可以缩短绒毛细胞培养时间,绒毛染色体核型异常是胚胎停育的重要因素。     

孕早期宫颈分泌物中获取胎儿细胞DNA进行产前诊断的可行性

目的：探索获取胎儿细胞DNA用于产前基因诊断的可行性，及能否用于预期胎儿性别。方法：收集92例孕早期人工流产妇女宫颈分泌物和绒毛组织，提取宫颈分泌物中DNA，扩增Y染色体特异重复序列DNA。短期培养制备绒毛染色体，分析核型确定流产胎儿性别。结果：92例经绒毛染色体核型分析的人工流产胎儿中，正确预期胎儿性别72例，准确率78％。结论：采集孕早期宫颈分泌物，可获得胎儿滋养层细胞DNA用于产前诊断，其准确性和可靠性有待进一步提高。     

DC-SIGNR在人胎盘滋养层细胞中的表达及意义

目的:探讨DC-SIGNR在人胎盘绒毛组织中的定位及在体外培养滋养层细胞上的表达.方法:建立稳定的滋养层细胞原代培养体系,采用免疫组化单染及荧光双染的方法检测不同孕期正常胎盘绒毛组织及体外培养滋养层细胞上DC-SIGNR的表达.结果:DC-SIGNR主要表达于胎盘滋养层细胞、Hofbauer细胞及胎盘微血管内皮细胞的胞质及包膜,在原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中的DC-SIGNR的表达与在体组织表达一致.结论:DC-SIGNR表达于不同孕期的胎盘组织及体外分离培养滋养层细胞,为研究滋养层细胞上该受体在宫内感染中的作用提供体外实验的细胞学基础.     

巨细胞病毒感染的致病机制初探

目的 探讨人巨细胞(HCMV)的致病机制。方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对36例早孕人工流产妇女进行了HCMV抗体IgG、IgM的检测，对抗体阳性者的绒毛及蜕膜进行了HCMV的PCR检测，对DNA阳性者进行了绒毛蜕膜的病理切片分析。结果 HCMV免疫抗体阳性的31例患者仅有10例DNA阳性者绒毛蜕膜均发生了明显的病理变化，绒毛细胞滋养层增生过长，蜕膜变性坏死，伴淋巴细胞浸润。结论 绒毛蜕膜的病理改变可能参与了HCMV的致病机制。     

Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

背景：有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性,对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性,在消化结束时无需终止和清洗,有保护细胞表面抗原的特殊作用,因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。 目的：比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。 方法：新生5-7 d昆明雄鼠45只,取双侧睾丸胶原酶初步消化,混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组),不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1,3,5 min后显微镜下观察并拍照,比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间;获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率;通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞,经包被有干细胞标志分子CD90.2的免疫磁珠进行分选,将所得CD90+及CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记,流式细胞仪检测不同组别CD90+及CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。 结果与结论：不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异,其中 Accutase酶能更快获取单细胞悬液,其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组,其所得细胞总数高于其余2组,而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高,流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%,高于胰酶组及混合酶组(51.16%,71.27%);而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%,24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。     

HBV感染人胎盘滋养层细胞机制的初步探讨

目的 采用透射电镜观察HBV体外感染人胎盘滋养层细胞的超微结构变化.方法 HBV体外感染人胎盘滋养层细胞.ELISA检测培养上清中HBsAg,PCR检测细胞培养上清和滋养层细胞中的HBV DNA.HBV荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA量(拷贝/ml).透射电镜观察滋养层细胞的超微结构.结果 感染组滋养层细胞培养上清中HBsAg在PBS清洗后12 h时A值为0.942,96 h时上升为1.264.PCR检测感染组细胞培养上清和感染组细胞HBV DNA均为阳性.PBS彻底清洗后0、12、36、60、84 h感染组细胞培养上清的HBV DNA分别为:＜103,3×104,6×105,5×105,3×105拷贝/ml.透射电镜观察到感染组滋养层细胞膜附近存在包涵素(Clathrin)形式的内吞小体形成,并且发现内吞小体内存在病毒颗粒样结构.在感染组细胞粗面内质网内发现HBsAg特异性的纤维丝状结构.结论 HBV可能经包涵素依赖的细胞内吞形式进入滋养层细胞,进而实现感染细胞或通过胞释作用将病毒排至细胞的对侧而实现穿越滋养层细胞屏障.     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。 目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3 h 3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4 mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。 结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多(P < 0.05)。在作用3 h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组(P < 0.01)。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2 h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法

建立一种简便、快捷的人胎盘绒毛膜间充质干细胞(human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpc MSCs)分离培养方法。用手持电动匀浆器处理人绒毛膜,经酶消化后接种培养,用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8测定细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标记,成脂、成骨诱导分化试剂盒鉴定细胞的分化潜能。获得的人胎盘绒毛膜间充质干细胞为成纤维细胞样细胞,呈平行排列或漩涡状生长,高表达CD73、CD105、CD90,而CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR呈阴性,生长曲线为"S"型,经成骨或成脂诱导后,茜素红染色或油红O染色呈阳性。符合国际细胞治疗学会认可的间充质干细胞标准。建立了人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养新方法,结合了组织块法和酶消化法的优点,为绒毛膜间充质干细胞的应用提供基础。     

胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响*☆

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。 目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。 方法：取孕14 d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。 结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。关键词：胰酶;胶原酶;神经干细胞;细胞培养;鉴定;胎鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.019      

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。     

运用无胰酶植块法培养大鼠嗅鞘细胞的研究

目的:探讨无胰酶植块法进行大鼠嗅鞘细胞(OECs)培养对OECs形态特征的影响。方法:选用妊娠14d左右的SD雌性大鼠,取出其胎鼠,剥离嗅球,剪碎组织,分别用常规培养法无胰酶植块法分离OECs,用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基培养嗅鞘细胞,免疫荧光染色检测p75神经生长因子受体(p75 NG-FR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,同时测量0ECs轴突的长度。结果:无胰酶消化的OECs克隆团处有大量的OECs向外延伸,分离单个OECs发现与常规培养法相比,其神经细胞轴突显著伸长;常规培养法可获取1.04×10^7个细胞,无胰酶植块法可获取3.09×10^7个细胞。结论:无胰酶植块法可获取大量的OECs,且OECs的轴突较长。     

人绒毛膜滋养层细胞的分离纯化及鉴定

目的建立一种简便易行、经济有效的纯化培养滋养层细胞的方法.方法:取孕6-8w的正常绒毛组织10例,采用胰蛋白酶消化法分离细胞,将细胞随机分为两组(各5例),一组用淋巴细胞分层液进行纯化,另一组未纯化,最后用含15%胎牛血清的培养基培养细胞.用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定.结果本纯化的细胞阳性率为(68.6 2±2.69)%,纯化后的细胞阳性率为(91.60±1.55)%,两者之间的差异具极显著性意度( P<0.001).结论该法简便易行,经济有效,可获得纯度较高、合乎试验要求的细胞滋养层细胞.