人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。     

NOC2L基因重组慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.     

小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建小窝蛋白-1（Cav-1）重组慢病毒载体，并在293T细胞和小鼠中验证Cav-1过表达。方法将Cav-1基因克隆至慢病毒载体GV287，然后利用酶切、PCR扩增鉴定、阳性克隆鉴定及测序验证构建Cav-1重组慢病毒。将Cav-1重组慢病毒转染至293T细胞，通过荧光检测慢病毒转染效果，采用Westernblot法检测Cav-1蛋白表达情况，同时转染C57BL6小鼠，免疫组化法检测小鼠肺组织中Cav-1的表达情况。结果经酶切、PCR扩增鉴定以及阳性克隆测序，提示Cav-1重组慢病毒构建正确。荧光检测显示转染Cav-1重组慢病毒后的293T细胞可见强荧光，Westernblot法检测结果显示目的基因可表达，小鼠肺组织中Cav-1呈强阳性表达，且实时定量PCR检测Cav-1重组慢病毒滴度为1.3×1012copies/ml，达到可利用标准。结论采用本研究方法可成功构建Cav-1重组慢病毒载体。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒(pGC-FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU/PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带TGF-β1的重组慢病毒表达载体,为TGF-β1基因转染骨髓间充质细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法利用基因克隆技术将TGF-β1基因定向克隆至慢病毒载体,构建TGF-β1基因重组质粒,并进行PCR、酶切和测序鉴定,并通过脂质体LP2000的介导慢病毒293T细胞。结果采用基因克隆技术构建的TGF-β1重组慢病毒经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,转染293T细胞能够正确表达。结论基因克隆技术能成功构建TGF-β1重组慢病毒载体,转染293T细胞后能够正确表达,为TGF-β1基因转染骨髓间充质细胞(BMSCs)诱导免疫移植耐受的研究奠定基础。     

人神经营养素3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带人神经营养素3(hNT3)基因的重组慢病毒表达载体。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,将该质粒转化大肠杆菌DH5α,通过PCR、酶切、测序和对比验证hNT3,通过Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,经大量扩增后,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度。结果:克隆得到512 bp目的hNT3全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,hNT3基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现hNT3基因的表达,且病毒滴度为5×107TU/L。结论:成功构建表达人hNT3基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为基因转染的有效工具在将来神经损伤修复实验研究中得到应用。     

Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定. 用LV-shSmad4,pCMV-dR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果:PCR和测序证实,成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.     

人高迁移率族蛋白组A1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定人高迁移率族蛋白组A1(HMGA1)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法:针对已经筛选确定的HMGA1基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体(含U6启动子和绿色荧光蛋白)连接产生LV-sh HMGA1慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-sh HMGA1慢病毒载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0等3种质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR和测序证实,成功构建LV-shHMGA1的慢病毒载体,病毒滴度达5×107TU/ml。结论:人HMGA1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建为进一步应用RNAi技术研究HMGA1基因的功能打下了基础。     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。     

含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。     

胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆

目的：分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体，并探讨其意义。方法：设计2对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点，以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中，并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果：K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论：LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行，可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

抑癌基因p16^INK4真核表达转移载体的构建

目的　构建可应用于昆虫杆状病毒表达系统的含抑癌基因p16 INK4cDNA的重组转移载体。方法　采用定向克隆方法将抑癌基因p16 INK4cDNA全长插入转移载体质粒pSXIVVI X3,并经斑点杂交 ,PCR及酶切鉴定重组质粒。结果　经三种鉴定方法证实p16 INK4cDNA片段成功地插入转移载体pSXIVVI X3。结论　重组质粒pSXIVVI X3 p16构建成功 ,为真核表达抑癌基因p16 INK4奠定了基础。     

Construction of eukaryotic expression vector encoding ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Sj and its expression in HeLa cells

Objective： To clone and construct the recombinant plasmid containing ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Schistosomajaponicum,（SjAslp） and transfer it into mammalian cells to express the objective protein. Methods： By polymerase chain reaction （PCR） technique, SjAslp was amplified from the constructed recombinant plasmid pBCSK＋/SjAslp, and inserted into cloning vector pUCm-T. Then, SjAslp was subcloned into an eukaryotic expression vector pcDNA3.1（＋）. After identifying it by PCR, restrictive enzymes digestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transfected into HeLa cells using electroporation, and the expression of the recombinant protein was analyzed by immunocytochemical assay. Results： The specific gene fragment of 558 bp was successfully amplified. The DNA vaccine of SjAslp was successfully constructed. Immunocytochemical assay showed that SjAslp was expressed in the cytoplasm of HeLa cells. Conclusion： SjAslp gene can be expressed in eukaryotic system, which lays the foundation for development of the SjAslp DNA vaccine against schitosomiasis.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

Ksp-Gpx1-k1k1载体的构建及鉴定

OBJECTIVE: To construct a Gpx1 and klk1 recombinant vector containing the kidney-specific promoter Ksp-cadherin. METHODS: Human Gpx1, Klk1 and Ksp-cadherin cDNAs were amplified with PCR and inserted in a stepwise manner into the expressive vector pIRES-EGFP to construct the recombinant vector Ksp-cadherin-Gpx1-Klk1. The constructed vector was verified with restriction enzyme digestion and sequence analysis. RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant expression vector Ksp-cadherin-Gpx1-Klk1 was constructed and identified successfully, which provides a potent tool for preparing transgenic animals to investigate gene therapy for ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation.