人源噬菌体抗体对Peroxiredoxin I高表达肺腺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的：研究表明过氧化物酶Peroxiredoxin I （Prx I）与癌症的发展有密切关系。我们已通过噬菌体展示技术构建了肺腺癌相关的人源单链抗体库。本研究对该库进行筛选,得到抗PrxI肺腺癌单链抗体,并检测其对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法：PCR法检测TG1中scFv基因插入率,1％琼脂糖凝胶电泳鉴定蹄I和Not I双酶切质粒的结果,以A549细胞及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原分别对抗体库进行3轮筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。放射性核素计数法测定细胞单链抗体内摄水平,MTT法及流式细胞术检测单链抗体对A549细胞的增殖抑制和凋亡情况,免疫印迹法检测抗体作用A549细胞后PrxI的表达水平。结果：scFv基因插入率为77％,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中．肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。ELISA法检测到在随机选取的10个克隆中．有6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率60％。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗Prx I肺腺癌单链抗体。被A549细胞内摄的单链抗体介导了细胞的凋亡以及细胞内PrxI蛋白表达水平的下降。结论：从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗PrxI肺腺癌单链抗体。单链抗体与肺腺癌细胞有特异性亲和力,并能有效抑制其增殖。     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

抗人肺腺癌单链抗体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建抗肺腺癌的单链抗体(scFv),研究其表达条件,为将这一小分子抗体应用于临床奠定基础.方法:将抗人肺腺癌单克隆抗体的重链及轻链可变区基因插入表达载体pFUW80、pTH、pTF,分别在大肠杆菌XL1-Blue、Top10、GI698/GI724中诱导表达,得到噬菌体抗体或包涵体.用SDS-PAGE和ELISA鉴定检测活性.结果:SDS-PAGE的结果表明,在pTH和pTF的表达产物中,有一条43kD的特异条带,其分子量与预期相符,单链抗体以包涵体形式出现,其表达量达细菌总蛋白的18.6%.ELISA的结果表明,噬菌体抗体和经复性处理的包涵体具有与亲本单抗相同的特异性.结论:成功地构建和在大肠杆菌中表达了抗肺腺癌单链抗体.     

单链抗体阿霉素结合物对人肺腺癌细胞体外生长的抑制作用

目的观察抗肺腺癌单链抗体(ScFv)2A7-1-阿霉素(ADM)结合物对人肺腺癌细胞体外生长的抑制作用。方法从抗肺癌可溶性ScFv抗体分泌克隆2A7-1E清提取可溶性抗体,浓缩、亲和层析纯化,以分光光度计测定浓度。戊二醛法连接2A7-1、ADM制备结合物,分光光度计测定结合物中所含2A7-1和ADM的浓度,计算结合比例。集落形成试验观察该结合物对肺癌细胞体外生长的抑制作用。结果制备的2A7-1-ADM结合物中,ADM和2A7-1的克分子比为3：1。连接后的2A7-1-ADM免疫结合物仍可特异结合肺腺癌A2细胞,其对肺癌细胞的抑制作用是单纯使用ADM的4倍。结论2A7-1-ADM免疫结合物对肺癌细胞的生长抑制作用明显强于单独使用ADM,具有潜在的临床应用价值。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

抗内毒素噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建一个鼠源性的抗内毒素单链噬菌体抗体库,从中筛选出对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。方法从小鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因（VH,VL）,用Linker将VH,VL交联形成单链抗体可变区片段（ScFv）。经NotⅠ,SfiⅠ双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经ELISA检测抗内毒素ScFv。结果小鼠血清中抗内毒素的效价为1∶12800。提取的总RNA浓度为12.3813μg/ml,纯度较好。扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。结论成功地构建了一个库容量为1.9×107的鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库,并从中筛选出了2株抗内毒素ScFv。     

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。     

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的：利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法：从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞（PBMC）,提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链（VH）和轻链（VL）基因,经重叠延伸PCR（SOE-PCR）,在体外将两者连接成单链抗体（scFv）基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果：得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论：本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析

目的：〖HT5"SS〗应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。〖HT5W〗方法: 〖HT5"SS〗以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。〖HT5W〗结果: 〖HT5"SS〗经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBADgIII/A中,经诱导表达、SDSPAGE和Western blotting分析,在相对分子质量30 000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd 值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力（ Kd值为5.24×10-6mol/L）相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。〖HT5W〗结论:〖HT5"SS〗 经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。     

全人源食管癌单链抗体scFv 基因文库的构建

 目的 制备全人源化食管癌单链抗体scFv基因文库。方法 取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源，提取总RNA，用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker，用SOE-PCR技术将它们拼接成SCFv，再引入酶切住点Sfi I和Not I，胶回收PCR产物获得SCFv。将SCFv基因克隆入噬菌粒载体pCANT心5E后电转入Ecoli TG1。PCR法鉴定抗体基因插入率，1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果 食管癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp。VL基因为350bp，组装后的scFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率为2×10^7efu／μg，SCFv的阳性插入率为91．7％（22／24）。结论 食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步筛选单链抗体库奠定了基础。     

SOCS3基因在人肺腺癌细胞株A549中的表达及其对细胞增殖的影响

目的 探讨SOCS3基因在人肺腺癌细胞株A549中的表达及其对细胞增殖的影响。方法 以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至人肺腺癌细胞株A549，利用G418筛选获得阳性克隆；应用RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3表达情况；采用四甲基偶氮唑兰(MTT)显色法检测基因转染前后细胞生长情况；应用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果 RT-PCR和免疫细胞化学法证实转染前A549细胞中无SOCS3基因表达，转染后A549细胞中SOCS3基因呈稳定表达。MTT检测显示转染pEFSOCS3的A549细胞生长明显受到抑制，抑制率为41．07％。流式细胞仪检测结果显示转染pEFSOCS3的A549细胞Go／G，期细胞比例显著增高，S、G2／M期细胞比例显著降低。结论 SOCS3蛋白可能通过负性调控细胞内信号通路抑制肺癌细胞增殖。     

腺病毒介导的RNAi技术抑制Peroxiredoxin Ⅰ的表达

目的:为深入研究PeroxiredoxinⅠ(Prx-Ⅰ)基因与肿瘤细胞放射敏感性的关系,构建基于腺病毒的抑制Prx-Ⅰ基因表达的RNAi载体。方法:从质粒载体pAVU6-Prx切下包含U6启动子在内的表达盒,连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack,然后在大肠杆菌中重组为完整腺病毒DNA,并将其转染293包装细胞制备腺病毒颗粒,再利用腺病毒感染目的肿瘤细胞,干扰其Prx-I基因的表达。结果:成功地将U6表达盒连接到穿梭载体,获得重组的腺病毒DNA,并制备出高滴度病毒。将病毒感染肿瘤细胞SW480以后可以明显抑制Prx-Ⅰ基因的表达,并使细胞受辐射后的细胞凋亡比例增大。结论:基于腺病毒的RNAi干扰是有效的,这为进一步在体内探讨肿瘤放疗增敏机制奠定了基础。     

白花檵木对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用

目的 探讨白花檵木粗提物对肺腺癌A549细胞体外增殖的影响.方法 CCK-8法检测不同浓度白花檵木粗提物对A549细胞增殖的影响;集落形成实验检测白花檵木粗提物对A549细胞克隆生长能力的影响;流式细胞Annexin V-APC/PI双染法检测白花檵木粗提物诱导A549细胞凋亡的情况;免疫印迹法检测白花檵木粗提物处理后...     

α-干扰素与肉桂酸对人肺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的:有研究表明肉桂酸对肿瘤细胞有抑制作用。本实验拟进一步研究α-干扰素(alpha-interferon,α-IFN)与肉桂酸(cinnamicacid,CINN)单独及联合作用对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用。方法:用α-IFN和CINN处理人肺腺癌A549细胞,通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验、甲基绿-派洛宁染色、流式细胞术(FCM)测定等方法来研究其对细胞的增殖抑制作用。结果:与对照组相比,α-IFN和CINN能明显抑制A549细胞增殖(P<0.05),促进细胞分化(P<0.05),α-IFN和CINN联合应用时抑制作用较二者单独作用时强;细胞在软琼脂中集落形成率明显下降(P<0.05);FCM显示细胞周期移行被阻滞于G1/G0期。结论:CINN联合α-IFN能抑制肺腺癌细胞增殖,α-IFN和CINN两药联合作用效应强于α-IFN或CINN单独作用。     

Rb基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

目的：探讨重组腺病毒载体的转染效率及其介导外Ｒｂ基因进肿瘤细胞的效果，观察外源Ｒｂ基因在肿瘤细胞内的表达及其对捉瘤细胞生长的抑制作用。为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法：构建Ｒｂ基因重组腺病毒载体。体外转染人肺腺癌细胞标ＧＬＣ－８２。应用免疫组化和聚合酶链反应等技术，观察Ｒｂ基因在细胞内的状态及表达情况。应用细胞计数及流式细胞仪检测肿瘤细胞的生长情况。结果：ＧＬＣ－８３细胞内存在基因组Ｒｂ基因，但     

藏红花素对人肺腺癌SPC-A1细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨藏红花素（Crocin）对肺腺癌SPC A1细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度（1、2、4、8、16mg／ml）的Crocin对人肺腺癌SPC A1细胞体外生长的抑制作用,倒置显微镜下观察细胞形态学改变;采用Annexin V FITC／PI荧光双标流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期;采用RT PCR法检测凋亡相关分子p53、Bax和Bcl-2的mRNA表达水平。结果 Crocin作用SPC-A1细胞24、48、72h后,细胞生长受到明显抑制且呈剂量依赖性。不同浓度Crocin处理48h后,倒置显微镜下SPC-A1细胞形态表现为皱缩、变圆等细胞凋亡性状。不同浓度Crocin处理48h后,各浓度组SPC-A1细胞的凋亡率增加且呈剂量依赖性;随着Crocin作用浓度的增加,SPC-A1细胞生长更多地阻滞在G₀／G₁期,而S期、G₂／M期的细胞比例逐渐降低。RT-PCR法检测显示,随着Crocin浓度的增加,SPC-A1细胞中p53、Bax mRNA水平上调和Bcl-2 mRNA水平下调。结论 Crocin可以抑制人肺腺癌SPC-A1细胞增殖和诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡,这可能与其对p53、Bax和Bcl-2的调控有关。     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.