TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于检测人载脂蛋白A5(apo A5)基因。方法针对人apo A5基因设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,以重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为103拷贝/μL;扩增效率(E)为110.2%,且重复性好。结论成功建立检测人apo A5基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR。该法具有较好的灵敏度、特异性及重复性。     

成骨细胞条件性FKBP8基因敲除小鼠模型构建

目的建立成骨细胞条件性FKBP8基因敲除小鼠模型、为研究FKBP8基因在骨质疏松症中的作用机制提供动物模型。方法设计基因敲除策略,获得纯合子小鼠和野生型对照小鼠。提取鼠尾DNA,PCR扩增之后琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。提取小鼠原代成骨细胞蛋白质,利用Western blot技术检验FKBP8基因的表达。结果成功构建成骨细胞条件性FKBP8小鼠敲除模型,PCR结果显示基因型为BGLAP-Cre/FKBP8flox/flox,Western blot结果显示FKBP8基因蛋白表达敲除效果明显。结论基于Cre/loxp重组酶系统,成功构建出FKBP8基因敲除鼠,为探究FKBP8在骨质疏松症的作用机制提供动物模型。     

水通道蛋白1基因敲除对胸腔液体转运的影响

目的:探讨水通道蛋白1在小鼠胸腔液体转运的作用。方法:实验小鼠分为野生型组和基因敲除型组,每组基因型各分为高渗组和低渗组。小鼠吸入麻醉后,胸膜腔内分别注入高渗或等渗液体,处理组液体中含特布他林100μmol·L-1或阿米吡嗪200μmol·L-1。在不同时间收集胸腔液体,测量渗透压或体积。结果:胸膜腔内注入500mOsm液体后,在1,2和5min时收集胸腔液体测渗透压,野生型组中渗透压均明显高于基因敲除组(P<0.01)。胸腔内注入等渗液体后,在30,60和90min时收集胸腔液体测量体积,野生型组和基因敲除型组间无明显差异(P>0.05)。特布他林增加高渗和等渗液体胸腔转运(P<0.05),不受水通道蛋白1敲除的影响。阿米吡嗪抑制高渗和等渗液体胸腔转运(P<0.05),也不受水通道蛋白1敲除的影响。结论:水通道蛋白1促进渗透压引起的小鼠胸腔液体转运,对胸腔等渗液体清除无影响。钠通道影响胸腔高渗和等渗液体转运,水通道蛋白1基因敲除不影响钠通道的这种作用。     

脑卒中病理变化的机制:PSD93在血小板活化因子性神经元损害中的作用

目的:探讨PSD93基因是否参与血小板活化因子所致的神经元毒性损伤,以研究血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)神经性损伤的分子学机制。方法:实验于2003-05/2004-05在南京鼓楼医院神经科研究室和美国约翰霍普金斯大学Dr.Tao实验室进行。用原代神经元细胞培养系统,PAF处理wildtype(野生型)和PSD93Knockout(基因敲除)小鼠皮质神经元;propidiumiodide/calceinAM染色进行细胞凋亡测定。荧光显微镜下数码相机拍照。结果:0.10,0.30和0.60μmol/LPAF对野生型和PSD93基因敲除型两种皮质神经元细胞具有明显的神经元毒性P<0.05)。基因敲除型(型的小鼠皮质神经元细胞凋亡明显低于野生型(P<0.01)。结论:PSD93基因敲除型可抑制PAF所致的神经元损害。     

快速鉴定苯丙酮尿症模型小鼠基因型的新方法应用

目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型。方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132bp片段,将该产物予Alw26I酶切后,加入微量SYBR Green I,在实时PCR仪上行融解曲线分析,同时,酶切产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。DHPLC法是直接将132bp片段扩增产物采用在部分变性条件下(60.9℃)行DHPLC分析,根据不同图谱作出基因型诊断。结果:融解曲线分析表明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃出现2个融解峰,突变纯合型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃出现2个融解峰,杂合型小鼠DNA片段则在84℃、81℃和76.5～77.5℃均出现融解峰,3种峰型明显可被区分。DHPLC优化了最佳分离效果的柱温,在优化的最佳条件下,DHPLC图谱显示杂合型小鼠DNA具有显著特色的峰型,即除同源双链峰外,出现一个异源双链峰。上述2种新方法共检测了PKU模型小鼠突变纯合型20只、杂合型22只,野生型11只,2种方法检测结果一致,并且与经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法结果一致(动物毛色等表型也完全一致)。结论:融解曲线法和DHPLC法均能准确、快速地鉴定模型小鼠的基因型,具有自动化、高通量等优点。     

多通道Taqman-探针荧光定量PCR 鉴定MRSA方法的建立

目的 建立基于mec A/nuc/fem B三基因联合的Taqman-探针荧光定量PCR鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法 以常规检验标本中分离和采用VITEK 2 Compact微生物分析仪鉴定为凝固酶阳性的MRSA为研究对象,通过PrimerPremier5.0和Beacon Designer 7软件设计针对mec A/nuc/fem B特异性PCR引物及Taqman荧光探针,荧光探针5'端分别采用FAM,HEX及ROX标记,3'端采用BHQ1标记,在荧光定量PCR仪进行检测。结果 ①1 g/dl凝胶电泳结果显示mec A/nuc/fem B三个基因引物特异性较好,扩增出的条带分子量与预期分子量一致且未见非特异性扩增; ②在单管单通道及单管多通道的PCR检测中mec A/nuc/fem B均获得特异性扩增,且三个基因在单管多通道的PCR扩增效果与单管单通道的相类似。结论 成功建立了多通道Taqman-探针荧光定量PCR鉴定MRSA的方法,mec A/nuc/fem B三种基因联合检测可有效区分凝固酶阴性和阳性的MRSA,提高鉴定MRSA的准确率。     

脑卒中病理变化的机制：PSD93在血小板活化因子性神经元损害中的作用

目的：探讨PSD93基因是否参与血小板活化因子所致的神经元毒性损伤，以研究血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)神经性损伤的分子学机制。方法：实验于2003-05／2004-05在南京鼓楼医院神经科研究室和美国约翰霍普金斯大学Dr．Tao实验室进行。用原代神经元细胞培养系统，PAF处理wild type(野生型)和PSD93 Knockout(基因敲除)小鼠皮质神经元；propidium iodide／calcein AM染色进行细胞凋亡测定。荧光显微镜下数码相机拍照。结果：0．10，0．30和0．60μmol／LPAF对野生型和PSD93基因敲除型两种皮质神经元细胞具有明显的神经元毒性(P&;lt;0．05)。基因敲除型型的小鼠皮质神经元细胞凋亡明显低于野生型(P&;lt;0．01)。结论：PSD93基因敲除型可抑制PAF所致的神经元损害。     

荧光定量PCR检测弓形虫基因方法的建立

目的　建立荧光定量PCR检测弓形虫基因的方法,并进行实验室方法学评价。方法　PCR扩增弓形虫 529bp重复序列,经TA克隆后转化入大肠杆菌DH5α中;提取重组质粒鉴定后,作为模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验和临床标本检测。结果　用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数 0. 995,平均试验间变异系数 3. 28%,无非特异性扩增。临床标本检测阳性率为 43. 3%。结论　建立了检测弓形虫基因的荧光定量PCR方法,快速、灵敏、特异的特点适合临床实验室的应用。     

2 mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的应用

目的 探讨2mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的作用.方法 (1)按SP级动物饲养标准进行饲养和繁殖;以UT-B基因敲除纯合子(UT-B-/-)成年雄鼠与C57/bl雌鼠合笼,繁殖出UT-B基因敲除杂合型小鼠(UT-B /-,F1代),F1代UT-B /-雄、雌鼠交配获F2代小鼠.(2)取F2代小鼠剪尾提取基因组DNA进行核型鉴定筛选纯合子小鼠(UT-B-/-)和野生型小鼠(UT-B / );(3)应用2 mol/L尿素溶血试验和肾脏RT-PCR进行UT-B-/-(Jknull)表型鉴定.结果 (1)在SP级饲养和繁殖的条件下,已获得足够的UT-B-/-和UT-B / 小鼠;(2)2 mol/L尿素溶血试验证明,UT-B / 小鼠和UT-B /-小鼠的红细胞加入到2mol/L尿素中立刻溶血,UT-B-/-小鼠的红细胞10 min内不溶显示溶血抵抗.结论 2 mol/L尿素溶血试验可准确地鉴定出UT-B-/-小鼠,与基因组DNA的PCR鉴定方法联合应用,可以使引进的UT-B-/-小鼠稳定繁殖、传代.     

内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠心肌细胞对苯福林诱导的过度增殖反应

目的:通过RNA定量检测和细胞面积测定两种方法,观察内皮型一氧化氮合酶基因敲除与野生型新生小鼠的离体心肌细胞对心肌肥大诱导因子反应性的差异.方法:实验于2007-08在顺德职业技术学院医学系实验研究中心完成.①实验材料:出生1～3 d C57BL/6品系内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠和野生型小鼠,雌雄不拘.②实验方法:对小鼠心肌细胞及成纤维细胞进行培养,72 h后分为实验组和对照组,将肾上腺素能受体激动剂苯福林掺入培养心肌细胞,另设空白对照组:在基础培养液中加入与实验组等量的DMEM.③实验评估:采用DNA、RNA定量检测、细胞面积测定方法,在细胞水平观察内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠和野生型小鼠心肌细胞增殖、肥大反应之间的差异.结果:①培养的心肌细胞在加入苯福林72 h后于显微镜下观察两组细胞均呈椭圆形、长菱形.②与对照组相比,实验组心肌细胞与成纤维细胞RNA检测及荧光值均增高(P＜0.05);空白对照组心肌细胞与成纤维细胞RNA检测荧光值均较实验组和对照组tE(P＜0.05).③与空白对照组相比,实验组和对照组心肌细胞与成纤维细胞面积荧光值均增高(P＜0.05);其中实验组心肌细胞面积荧光值较对照组高(P＜0.05).结论:内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠其离体心肌细胞在心肌肥大诱导因子刺激下产生过度增殖反应.     

12-脂氧化酶基因敲除对1型糖尿病肾病小鼠肾小球内纤维连接蛋白表达的影响

目的探讨12-脂氧化酶（12-lipoxygenase,12-LO）对1型糖尿病肾病小鼠肾小球内纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）表达的影响。方法用链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导1型糖尿病模型。野生型和12-LO基因敲除C57BL/6小鼠随机分成4组：野生型对照组;12-LO基因敲除组;野生型糖尿病组;12-LO基因敲除糖尿病组。采用RT-PCR和免疫组化方法分别检测肾小球内FN mRNA和蛋白表达的变化。结果与野生型对照组比较,野生型1型糖尿病小鼠血糖（P〈0.01）、肾重/体重比值（P〈0.01）和24小时尿白蛋白明显增高（P〈0.01）,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠尿白蛋白（P〈0.05）、肾重/体重比值（P〈0.05）明显低于野生型糖尿病小鼠。基础情况下,野生型和12-LO基因敲除小鼠肾小球内FN表达无差异。与野生型对照组相比,野生型糖尿病小鼠肾小球内FN表达明显增加（P〈0.01）,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠肾小球FN表达的增加（P〈0.05）。结论 12-LO基因敲除延缓1型糖尿病肾病小鼠蛋白尿的进展,降低肾小球内FN表达。     

同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒bla_(KPC-2)基因

目的建立敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的耐药基因的方法。方法聚合酶链反应(PCR)分别扩增试验菌株待敲除目的基因blaKPC-2的上下游片段及质粒pMQ300的潮霉素耐药基因片段,采用重叠延伸基因扩增(SOE-PCR)技术构建融合片段,以耐阿普霉素的λred质粒pKOBEG-Apr为介导,同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的blaKPC-2基因。用含潮霉素和阿普霉素的LB培养基筛选重组子,用PCR和逆转录PCR扩增检测blaKPC-2基因、潮霉素耐药基因及药物敏感性验证重组子。结果不同多位点序列分析(MLST)型别的2株临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的blaKPC-2基因得以敲除。结论λred同源重组法可以可靠敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的基因。     

腺苷A1受体敲除小鼠戊四氮点燃后脑组织病理形态学变化

目的:通过观察腺苷A1受体敲除小鼠戊四氮点燃后脑组织病理形态学变化,探讨腺苷A1受体的神经保护作用。方法:腺苷A1受体基因敲除纯合型(-/-)小鼠20只纳入敲除鼠组,腺苷A1受体基因敲除野生型小鼠20只纳入野生型组,C57BL/6小鼠10只纳入对照组。敲除鼠组和野生型组小鼠制作戊四氮点燃癫痫模型,于点燃成功后24 h、30 d采用尼氏染色观察各组小鼠海马及皮质神经元的形态结构变化。结果:野生型组小鼠点燃后皮质和海马神经元损伤较敲除鼠组出现晚、范围小,损伤程度轻。结论:腺苷A1受体对癫痫发作小鼠具有神经保护作用。     

白细胞腺苷A2A受体基因缺失小鼠模型的建立

目的建立选择性外周血自细胞腺苷A2A受体基因缺失的小鼠模型。方法分别采用一次9．5GyX线照射和2次6．2GyX线间隔照射对小鼠进行清髓处理，将腺苷A2A受体基因敲除的小鼠骨髓细胞移植到清髓性处理的野生型小鼠体内，使其白细胞的腺苷A2A受体选择性缺失，并对移植效果进行鉴定。结果通过基因型鉴定发现骨髓移植6周后受体小鼠的白细胞性染色体基因PCR产物电泳条带为300和330bp；腺苷A2A受体阳性细胞率为10．21％，而野生型小鼠为96．72％；2次分割放疗结合大于6×10。个骨髓细胞的移植量可以得到满意的小鼠存活率（91％）。结论成功地建立了选择性缺失白细胞腺苷A2A受体基因的小鼠模型。     

延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

背景:小鼠肝损伤模型已被广泛应用,大鼠肝损伤模型能在发病机制,肝移植环境等方面更好地模拟人,建立大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetat hydrolase,Fah)基因敲除的胚胎干细胞株是大鼠肝损伤模型建立的重点和难点。目的:建立Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株。方法:根据Genbank检索出的大鼠Fah基因序列构建带有正负双向筛选系统的Fah基因敲除载体pKO-Fah,并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养,通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠胚胎干细胞中,用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选,再对筛选出来的阳性克隆进行PCR验证。结果与结论:电穿孔转染后观察到绿荧光胚胎干细胞克隆,经过3轮嘌呤霉素药物筛选后约有90%的胚胎干细胞克隆表达绿荧光,成功挑取到2个稳定表达绿荧光的胚胎干细胞克隆,重组胚胎干细胞-Fah,通过PCR鉴定为正确同源重组的阳性克隆。提示大鼠胚胎干细胞稳定建系后,能通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞,并为后期基因敲除动物的建立奠定基础。     

miR-155表达与FLT3-ITD+急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及机制研究

目的:研究miR-155的表达与FLT3-ITD⁺急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及潜在的调控机制。方法:通过CRISPR/Cas9基因编辑工具在FLT3-ITD⁺AML细胞系MV411中实现miR-155编码基因敲除,筛选单克隆细胞,PCR及Sanger测序鉴定单克隆细胞的基因型,实时荧光定量逆转录PCR鉴定成熟miRNA的表达水平。MTT法计算半数抑制率,比较MV411细胞对多柔比星、奎扎替尼以及米哚妥林的药物敏感性。转录组测序分析miR-155敲除后MV411细胞mRNA水平的变化,基因集富集分析获得miR-155敲除后的信号通路的变化水平,Western blot验证信号通路关键分子的表达。结果:通过PCR初筛和Sanger测序获得了4个基因敲除的杂合子和1个基因插入的杂合子。实时荧光定量逆转录PCR结果显示,这些单克隆细胞中成熟miR-155的表达显著低于野生型克隆。MTT结果显示,与野生型相比,miR-155基因敲除后MV411细胞对多种抗FLT3-ITD⁺AML的药物敏感性有了显著增加。RNA测序显示m...     

空肠弯曲杆菌中喹诺酮类抗生素耐药基因检测与耐药性研究

目的 建立一种检测人粪便样本中,空肠弯曲杆菌含喹诺酮类抗生素耐药基因情况的实时荧光PCR方法,并对空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药性与耐药基因的相关性进行初步研究。方法 根据空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药基因gyrA和gyrB序列设计引物,建立对应的实时荧光PCR方法,对79例空肠弯曲杆菌进行检测,基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。以药敏试验结果作为参照标准,对两种检测方法的结果进行统计学分析,计算实时荧光PCR的主要技术指标。结果 22例(27.8%)空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR出现特异性扩增曲线,扩增产物电泳结果显示其中13例携带gyrA基因(59.1%),7例携带gyrB基因(31.8%),2例同时携带gyrA和gyrB基因(9.1%)。药敏试验显示26例空肠弯曲杆菌为环丙沙星耐药型(32.9%)。统计学分析显示,两种方法的检测结果差异无统计学意义(χ² =1.125,P>0.05),一致性较好。实时荧光PCR法的灵敏度和特异度分别为76.9%和96.2%,总符合率为89.9%。结论 实时荧光PCR法能够检测空肠弯曲杆菌耐药基因gyrA和gyrB。耐药基因与耐药型之间有所关联,需要进一步研究。     

EGFR基因T790M突变COLD-PCR扩增体系的Tc值筛选

目的筛选表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变PCR扩增体系的Tc值并初步建立具T790M突变富集效果的低变性温度下的复合聚合酶链反应(COLD-PCR)体系,同时探讨Tc值的筛选策略以及注意事项。方法以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突变野生型和突变型标准样品,通过目标片段关键变性温度筛选实验、COLD-PCR反应模式比较实验以及Tc值的验证实验,确定COLD-PCR体系的Tc值并初步验证其效果。结果本实验体系T790M突变的目的扩增片段关键变性温度低于野生型片段,据此体系反应模式选择为快速COLD-PCR反应模式,同时确定Tc值为89.6℃,验证实验显示本体系可检出1%的T790M突变,较常规PCR提高5倍。至此T790M突变富集COLD-PCR扩增体系已成功建立。结论成功完成体系Tc值的筛选并建立T790M突变富集COLD-PCR扩增体系。     

分子信标与毛细管电泳--激光诱导荧光检测联合筛查野生型基因

目的 利用毛细管电泳——激光诱导荧光检测系统(CE—LIF)和分子信标杂交理论，建立一种新的聚合酶链反应(PCR)产物分析方法，以应用于野生型基因的临床筛查。方法 PCR扩增30例胃癌组织DNA的p73基因第3外显子、p53基因第5外显子和p16基因第2外显子，所得PCR产物与分子信标杂交，利用CE—LIF检测杂交产物，检出野生型基因。对照方法为单链构象多态性(SSCP)分析。结果 CE—LIF分子信标法与SSCP分析相比较，测得p73第3外显子野生型百分率分别为100％和100％；测得p53第5外显子野生型百分率分别为60．0％和63．3％(P=0．99)；测得p16第2外显子野生型百分率分别为20．0％和20．0％。结论 利用分子信标与CE—LIF联合检测野生型基因，是一种良好的筛选方法，高效快速、简便、成本低，适宜应用于临床。     

钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定

目的:建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法:将雄性C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST~(+/-)杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST~(-/-)小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果:C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST~(-/-)基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论:成功建立Balb/CCAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。