低危骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性的实验研究

骨髓增生异常综合征的发病机制至今尚未明确，有研究表明MDS患者骨髓基质微环境功能的异常与其发病有关。间充质干细胞是造血微环境的重要成分，本研究拟探讨低危MDS患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性及功能．采集低危MDS患者的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态，进行免疫表型、成骨分化能力鉴定，检测其增殖能力及对体外造血的支持功能；用实时定量RT—PCR法测定MSC中相关细胞因子及化学趋化因子的表达，并与健康供者的MSC进行比较。结果表明：培养低危MDS患者的MSC呈典型的成纤维细胞样，细胞表达SH2（CD105），SH3（CD73），Thy—1（CD90），CD34及CD45均为阴性，诱导后可向成骨细胞分化。其体外扩增能力与与健康供者相比无显著差异（P〉0．05），但体外支持造血功能较后者显著减低（P〈0．05）。实时定量PT—PCR显示SDF—1在低危MDS患者MSC中显著高表达（P〈0.01）。结论：间充质干细胞的功能异常与低危MDS患者骨髓微环境的造血调控失常相关，这为MDS发病机制的认识及治疗提供了新的思路，值得进一步探讨。     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

造血干细胞移植后患者间充质干细胞增殖功能的研究

为了研究造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）后造血植活患者中骨髓源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的增殖能力,本研究选择造血干细胞移植后临床植活的34例患者作为研究对象,抽取34例患者及30例正常健康供者骨髓,进行微环境成纤维细胞集落形成单位（colony-formingunit-fibroblast,CFU-F）集落培养,同时对MSC进行培养传代,记录MSC的融合时间及传代总数;利用流式细胞术（flowcytometry,FCM）检测患者MSC表面抗原的表达;将此34例患者培养结果与30例正常对照结果进行比较统计。另外对其中骨髓加外周血加第二供者脐血移植的10例患者与骨髓加外周血移植的19例患者的MSC体外扩增指标进行比较统计。结果表明：34例患者中有31例（91.1%）患者的MSC原代培养能达到贴壁融合,有1例（2.9%）达到部分融合,2例（5.9）未达融合;与正常对照相比,患者的MSCs融合时间明显延长,传代总数明显减少,CFU-F数明显降低,即其MSC的体外扩增能力明显受损。骨髓加外周血加第二供者脐血移植的10例患者与骨髓加外周血移植的19例患者相比,MSC达到融合的时间短,体外传代总数多,CFU-F计数高。结论：移植后患者的MSC呈明显受损状态,加用第二供者脐血细胞能部分改善患者MSC体外增殖功能。     

冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究

为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)生物学特性和支持造血能力的影响,采用常规方法分离培养骨髓MSC,将传代后的细胞用含10%二甲亚砜、40%胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中,观察短期(4周)和中期(9-15月)复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力,并同冻存前的MSC进行比较。结果表明:中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)%和(93士2.51)%;冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落(CFU-GM,CFU-E,CFU-GEMM)的生长作用和冻存前MSC相似。结论:骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后,细胞活性略有下降,但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。     

骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用.体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系.将免疫磁珠分选的CD34^＋脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞（1：2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较.结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用.结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用.     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

富血小板血浆优化培养间充质干细胞的实验研究

目的探讨以人富血小板血浆(PRP)取代动物血清培养可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的新方法。方法骨髓标本取自行全髋关节置换术的造血功能正常患者的近端股骨。有核细胞2×10~5/cm~2接种于25 cm~2培养瓶中培养 MSC,比较含12.5% 胎牛血清(FCS)和12.5% 马血清的完全 Dexter 培养液,含10.0% FCS 的α-MEM 培养液和含5% PRP 的α-MEM 培养液三种培养体系的扩增效果。有核细胞1×10~6与采自健康供者髂骨的相同数量的骨髓细胞分别接种于25 cm~2培养瓶,14 d 后计数成纤维细胞集落(CFU-F)。结果从近端股骨中分离和扩增的细胞呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定 CD34、CD45阴性,SH2(CD105)、SH3(CD73)、Thy-1(CD90)阳性,体外诱导可向成骨细胞分化。其中含5% PRP 的培养体系较其他两种传统培养方法具有显著增强的 MSC 扩增效果且不改变细胞表型及分化功能;来源于近端股骨的骨髓细胞 CFU-F 较常规髂骨穿刺物显著增高(分别为89±17和16±5,P<0.01)。结论建立以 PRP 取代 FCS 的培养体系,并采用取自外科手术中近端股骨的骨髓标本可在体外高效扩增可备临床细胞治疗应用的 MSC。     

脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的探索体外培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcell,MSC）的方法,为人骨髓间充质干细胞移植于受损心脏、改善心脏功能的研究打下基础。方法采用Percoll（1．073g／ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液体外培养扩增骨髓MSC,并通过FCM对其纯度进行鉴定。结果Percoll液能成功分离出骨髓间充质干细胞。原代及传代培养显示人骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。体外扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD29、CD166等表面抗原,不表达CD34、CD45等表面抗原。结论人骨髓间充质干细胞作为一种具有多分化潜能的多能干细胞,具有强大的分裂增殖能力,体外培养无明显的分化倾向．     

初诊急性髓系白血病患者来源的骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强

目的:探讨急性髓系白血病(AML)患者骨髓微环境对间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响。方法:从初诊的AML患者骨髓中分离得到MSC,在倒置显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术测定其免疫学表型,MTT法检测其增殖能力,以成骨、成脂肪和成软骨诱导检测MSC的多向分化能力。结果:从初诊AML病患者骨髓中分离得到的MSC呈现出经典的成纤维细胞样形态;其细胞表面高表达CD29,CD44,CD73,CD105和HLA-ABC,低表达CD14,CD31,CD34,CD45,CD80,CD86和HLA-DR。与健康人骨髓MSC相比,其增殖能力未见显著差别,但是其成骨细胞分化的能力显著增强。结论:初诊的AML患者骨髓中存在的MSC具有与健康人骨髓MSC相似的细胞形态、免疫表型和增殖能力,但是其成骨分化能力显著增强。     

骨髓增生异常综合征患者源成骨细胞表达多种细胞因子并体外维持造血祖细胞存活

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者成骨细胞的生物学特性,并探讨其对体外造血的支持能力,利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能将其诱导分化为成骨细胞,在体外和造血细胞构建二维培养体系,研究其体外支持造血祖细胞生存的作用;同时采用RT-PCR的方法在mRNA水平上分析由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞细胞因子的表达并与人成骨细胞系hFOB1.19比较。结果发现,来源于MDS患者的成骨细胞在无外源性细胞因子的条件下能够短期维持GM-CFC造血祖细胞的存活。经过RT-PCR证实,人成骨细胞系hFOB1.19表达SCF、IL-6、SDF-1α、G-CSF、GM-CSF等细胞因子,来源于MDS患者和正常人的成骨细胞也能表达上述细胞因子,但却不表达GM-CSF。结论：与正常人相比,MDS患者源的成骨细胞同样能够维持GM-CFC的存活,这可能和成骨细胞表达多种重要的造血相关的细胞因子有关。     

胎儿和成人骨髓间充质千细胞体外造血支持能力的比较

胎儿出生以后,造血干细胞(HSC)才从胎儿的肝脏和脾脏转移到骨髓,这一过程可能由不同的造血微环境中的信号分子所介导.间充质干细胞(MSC)是骨髓微环境中间质细胞如成骨细胞、内皮细胞的前体祖细胞.研究者推测,胎儿出生前的骨髓可能并不特别适合HSC生长.然而,该假说尚缺乏直接的证据支持.本研究通过对胎儿和成人骨髓MSC的造血支持能力进行比较,拟为此提供证据.成人骨髓MSC来源于3位健康供者,胎儿骨髓MSC来源于孕19-20周流产的胎儿.MSC辐照后与CD34+一起进行长期培养启动细胞分析,计数克隆形成细胞的数童,流式分析培养后CD34+的表型变化.RT-PCR分析两种MSC中细胞因子的表达.结果显示,成人骨髓MSC比胎儿骨髓MSC具有更强的造血支持能力,两者都促进CD34+向髓系细胞分化,两者之间细胞因子的表达存在差异.结论:与胎儿骨髓MSC相比,成人骨髓MSC在某些治疗,尤其是促进造血恢复方面具有更广泛的应用前景.     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞SDF-1基因的表达

本研究探讨骨髓基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达水平。采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,观察细胞形态并进行表型鉴定;以实时定量RT-PCR法检测间充质干细胞SDF-1基因和内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达水平,并与健康供者的表达水平相比较。结果发现,MDS患者骨髓间充质干细胞SDF-1基因的表达水平经GAPDH校正后为1.53±0.92,与对照组(5.51±0.99)相比差异非常显著(P<0.01)。结论:SDF-1基因在MDS患者骨髓间充质干细胞中的表达显著升高,SDF-1基因的异常表达可能影响MDS患者骨髓微环境的造血调控作用,是否可对MDS的发病机制及治疗提供新的思路值得进一步探讨。     

小鼠真皮间充质干细胞的生物学特性及促进造血恢复的研究

目的 了解小鼠真皮间充质干细胞(DMSC)的生物学特性，探索在体外DMSC作为滋养层能否促进造血细胞的增殖、分化，以及体内输入DMSC能否促进照射动物造血恢复。方法 体外采用液体培养，分离、扩增雄性小鼠DMSC，检测第2～3代细胞的生长状态、周期、免疫表型，并进行光镜和电镜形态观察。用DMSC作滋养层，接种去基质细胞的造血干细胞，观察细胞数及CFU-GM变化。将培养2～3代的DMSC通过尾静脉输给预先经^137 Cs全身照射5Gy的雌性小鼠，定期检测外周血和骨髓细胞总数及CFU-GM变化。结果 小鼠DMSC为贴壁细胞，表现为成纤维细胞样，具有梭形、多角形等细胞形态，免疫表型分析：CD45、CD34、HL-DR阳性细胞占l％～3％，CD44、CD1375％～95％阳性，细胞周期检测显示83％的细胞处于G0／G1期。体外实验，实验组细胞总数及CFU-GM值在第3周明显高于对照组，DMSC能有效地支持造血细胞增殖、分化达7周。体内试验，注射DMSC组外周血和一条股骨有核细胞数、CFU-GM值第2周都明显高于单纯照射组，第4周实验组有Y染色体阳性表达，证明输入细胞在受体内增殖、分化。结论DMSC具有干细胞特征，能促进照射小鼠造血恢复。     

DEFECTIVE LYMPHOCYTES SUPPORTING HEMATOPOIESIS IN PATIENTS WITH PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is an acquired hemo-lytic disease in which there is a stem cell disorder of clonal nature. Previous studies have demonstrated that the numbers of burst-forming units-erythroid (BFU-E) and colony-forming units-granulocyte / macrophage (CFU-GM) from bone marrow of PNH patients growing in the medium containing PHA-LCM from the normai donors were more reduced than those of normai bone marrow. The purpose of present study was to investigate if PNH lymphocytes are defective in supporting hematopoiesis in vitro. PHA-LCM from PNH blood was added to the culture medium for the growth of PNH and normai BFU-E and CFU-GM. The numbers of PNH bone marrow BFU-E and CFU-GM in the medium containing PHA-LCM from PNH blood were less than those from normai blood; the numbers of normai bone marrow BFU-E and CFU-GM grown in the medium containing PHA-LCM from PNH blood were more decreased than those from normai blood. The results suggest that diminished numbers of PNH bone marrovv BFU-     

骨髓增生异常综合征造血细胞生物学指标检测的意义

目的 研究骨髓增生异常综合征（MDS）造血细胞的生物学特性改变及与疾病进展的关系。方法对37例MDS患者骨髓细胞进行染色体核型分析、CFU－GM体外半固体琼脂培养、增殖细胞核抗原（PCR）表达、细胞周期分析以及造血克隆性检测,观察其对MDS疾病进展的关系。 结果 （1）MDS染色体异常检出率31％,随访过程中染色体核型正常的9例中有2例,异常的5例中有3例转化为急性髓系白血病（AML）。（2）MDS患者骨髓细胞体外CFU－GM集落产率减少、集簇产率增加。43％的患者CFU－GM产率极低或无生长。随访中9例CFU－GM集簇生长为主的患者中6例疾病进展或转化为AML;6例集落、集簇不生长和3例生长基本正常者中仅1例转化为急性白血病。（3）MDS患者骨髓细胞PCNA表达明显升高,RAEB／RAEB－t的PCN表达较RA／RAS高。（4）MDS患者骨髓细胞溴脱氧尿嘧啶（BrdU)标记指数减低（5．07％）,DNA合成期时间和潜在倍增时间延长,分别为8．57h和8．69d,并与病程进展关。（5）7例女性HUMARA等位基因为杂合子的RA患者中,2例为多克隆造血,5例为单克隆造血。3例RAEB和1例MDS／AML均为单克隆造血。结论 随着MDS病程进展,骨髓中原始细胞增多,造血细胞生物学特性呈现以下的演变趋势,造血转变为单克隆性;体外培养CFU－GM接近于白血病性生长特征;PCNA表达增高;细胞周期延长。     

骨髓基质细胞系QXMSC_1体外促进造血及其作用机理的研究

本实验研究了骨髓基质细胞系QXMSC_1体外对CFU-F,CFU-GM,BFU-E及CFU-E集落形成的影响,并通过建立QXMSC_1基质细胞与骨髓造血细胞的长期共培养体系,研究了QXMSC-1在体外促进造血的机理。结果表明,QXMSC_1基质细胞条件培养上清液可促进小鼠CFU-F,CFU-GM,BFU-E及CFU-E集落的生长。在无GM-CSF和Epo存在的情况下,QXMSC_1细胞能维持CFU-GM,BFU-E和CFU-E集落生长。表明QXMSC_1细胞本身可分泌GM-CSF和Epo。QXMSC_1细胞与骨髓造血细胞共培养时,可明显提高CFU-GM集落数。共培养体系中,用微孔滤膜隔断QXMSC_1与造血细胞的直接接触,也能促进CFU-GM集落生成,但比混合培养时低,说明QXMSC_1通过直接接触和分泌细胞因子促进造血的过程。