寡核苷酸的卟啉化学修饰及其产物纯化的研究

为探索寡核苷酸的修饰方法,合成了一种卟啉修饰的反义寡核苷酸并对其抑制c-myc靶基因表达的效果进行了初步探索。利用卟啉的1-羟基苯并三氮唑活性酯可将卟啉基团直接修饰在商品化的寡核苷酸片断上。用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合红外、紫外测定完成寡核苷酸偶合物的鉴定。与其他类似研究相比,此法简便易行,具有较宽的应用范围。     

c—myc的反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

目的 探讨ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸抑制培养大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究。方法 帖壁法培养血管平滑肌细胞,将不同浓度的反义正义寡核苷酸加入培养液,观察对血管平滑肌细胞增殖的作用。结果 ５μｍ／ｍｌ ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸加入培养液后第５、７天抑制血管平滑肌细胞增殖,１５μｇ／ｍｌ ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸加入培养液后第３、５、７天抵制血管平滑肌细胞增殖。各浓度ｃ－ｍｙｃ的正义寡核苷酸未发现其抑制血     

反义寡核苷酸对HL60细胞c—myc基因表达的抑制和诱导分化作用

研究ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达及ＨＬ６０细胞分化的影响。方法 采用针对原癌基因ｃ－ｍｙｃ的ｍＲＮＡ５’非翻译区的一个１８ｂｐ的反义寡核苷酸５‘ｄ（ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＧＧＧ）３「与人早幼粒白血病细胞系ＨＬ６０细胞共培养５ｄ，检测ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ量的变化及其对ＨＬ６０细胞分化的影响。     

脂质体技术促进c—myc反义寡核苷酸导入人体肝癌细？…

目的 观察脂质体技术促进ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸导入人体肝癌细胞的作用。方法 采用新一代脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔ＾ＡＭＮＥ（ＬＲ）包裹针对肝癌表达基因ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）,借助ＦＩＴＣ荧光标记ｃ－ｍｙｃ－ＡＳＯＤＮ,应用细胞培养方法及荧光分光光度计以及荧光显微镜。结果 ＬＲ促进ＡＳＯＮ进入靶细胞并增强其对肿瘤细胞基因的特异性封闭作用。结论 脂质体作为一种安全、简便、有效的基因转移载体广     

反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖

目的 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用。方法 大鼠气道平滑肌细胞原代培养，4－12代用于实验。利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞，MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，RT－PCR检测c-myc mRNA的表达，免疫组织化学染色检测c-myc蛋白的表达。结果 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，且这种抑制作用呈浓度依赖性；反义c-myc寡核苷酸可降低c-myc mRNA的表达，同时降低了c-myc mRNA的翻译。结论 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖。     

c—myc反义寡核苷酸对低氧内皮细胞条件培养液诱导的肺血管？…

应用细胞培养、核酸斑点杂交、Ｈ＾３－胸腺嘧啶核苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）掺入、免疫细胞化学、图像分析等技术观察ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对低氧内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ）诱导的大鼠肺血管周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达及＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量的影响。结果表明,ＨＥＣＣＭ显著促进周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、ＰＣＮＡ表达（Ｐ〈０．０１）及＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量增加（     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（18mer，21mer）对人白血病HL—60细胞中c－myc基因表达的抑制作用。用HL－60活细胞计数，RNA含量的RT－PCR测定和c－myc基因蛋白的免疫组化染色检查。结果：两个反义寡核苷酸都能抑制HL－60细胞的增殖，增殖抑制率为11％～75％。反义核酸还抑制c－mycmRNA和Myc蛋白的表达，而对c－mcy基因正常表达的红白血病细胞K562的增殖和PHA刺激的人淋巴细胞的增殖没有影响。结论：反义寡核苷酸能抑制c－myc基因的过度表达。     

C—myc反义寡脱氧核苷酸抑制人乳腺癌细胞系生长的研究

采用胎盼蓝染色法，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验和流式细胞计数分析技术研究了ｃ－ｍｙｃ，ｍＲ－ＮＡ帽区反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系增殖及其ｃ－ｍｙｃ蛋白表达的影响，结果表明：ｃ－ｍｙｃ反义寡脱氧核苷酸能抑制人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系生长和增殖，这种抑制作用有明显的剂量依赖性，同时也能抑帛ＭＣＦ－７细胞ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达。     

反义寡核苷酸类药物的研究进展

反义寡核苷酸类药物通过与靶mRNA的相互作用调节目的基因的表达.它必须具备三个首要条件,即稳定性、选择性和通透靶向性.各种化学修饰包括第二代、第三代寡核苷酸明显增强了反义寡核苷酸的稳定性;靶序列选择方法的改进为其发挥高度选择性提供基础;各种靶向转运技术的应用大大增强了对作用部位的通透性和靶向性.这些方面的研究进展开阔了反义寡核苷酸类药物的应用领域.     

c—myc反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡的影响

目的 研究c-myc反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡的影响。方法 用针对c-myc mRNA 5'端非翻译区的一个18bp的反义寡核苷酸与HL60细胞、分离的急性粒细胞白血病病人白细胞共培养10h,用凋亡细胞计数、DNA凝胶电泳、ELISA、流式细胞仪等方法测白血病细胞的调亡。结果 c-myc反义寡核苷酸能够诱导HL60细胞凋亡,且此作用随着作用浓度的提高而增加;此反义核酸只诱导白血病患者的白血病细胞凋亡,对正常白细胞的凋亡无影响。结论 c-myc反义核酸可以通过诱导白血病细胞凋亡来治疗急性粒细胞白血症,且该作用的特异性好。     

针对汉坦病毒S基因反义寡核苷酸抗病毒效应的研究

目的：研究反义寡核苷酸（asON）体外抗汉坦病毒（HV）的效应。方法：设计合成了分别针对HV S基因片段5′端手柄状结构区的asON1和针对mRNA翻译起始区的asON2，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测asON作用后HV感染细胞培养上清中HV核蛋白（NP）的表达水平，免疫荧光试验（IFA）检测asON作用后感染细胞膜上NP的表达水平，空斑减少中和试验（PRNT）测定asON作用和HIV感染细胞培养上清液中病毒滴度。结果：asON可抑制NP的合成以及病毒活恬。结论：asON具有一定的抗HV作用，有可能作为一种治疗人HV感染的新途径。     

反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

OBJECTIVE: To examine the therapeutic effect of oncogene c-myb antisense oligodeoxynucleotide (AON) on rat C6 glioma in vivo. METHODS: C6 glioma cells were implanted into the subcutis of nude mice, the animals were randomly divided into three groups (12 mice respectively) when the tumor grew about 10 mm in size, and the mice with subcutaneous tumor foci were treated with sense oligodeoxynucleotide (SON), AON and normal saline. Three animals of each group were killed after treatment at 4, 8, 12 and 16 days respectively. The dynamic growth manifestations, features, histopathological changes and apoptosis of the glioma in each group were observed. RESULTS: AON suppressed the growth of C6 glioma cells, the suppression rates being 66.7%, 71.4%, 72% and 73% at 4, 8, 12, 16 days respectively (P < 0.05). The changes in weight were concurrent with the variations of tumor volume, the tumor weight of AON groups was significantly decreased (P < 0.05). The immunohistochemical assay showed the expression of c-myb proto-oncogenes was significantly decreased in AON groups (P < 0.05). The flow cytometry analysis found the apoptosis cell percentage of AON groups to be 13.4%, 27.1%, 46.1% and 48.4% at 4, 8, 12 and 16 days respectively, and this percentage of AON groups was about 3.5 times the apoptosis cell percentage of SON and control groups at the corresponding time. In addition, noticeable inflammatory infiltration and calcification were observed after the treatment with AON. CONCLUSION: The above findings indicate that c-myb gene might be associated with the suppression of carcinogenesis in brain glioma, and oncogene c-myb might be chosen as a target for antisense gene therapy of gliomas.     

反义myb寡核苷酸对内皮素诱导动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

合成反义和正义ｃ－ｍｙｂ１８－ｍｅｒ，分别导入培养的ＷＫＹ主动脉平滑细胞（ＳＭＣｓ），同时用内皮素诱导ＳＭＣｓ增殖。反义ｃ－ｍｙｂ寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对内皮素诱导ＳＭＣｓ的抗细胞增殖抑制作用随浓度（６０μｍｏｌ·Ｌ－１～１２０μｍｏｌ·Ｌ－１）的增加而增加。用１２０μｍｏｌ·Ｌ－１反义ＯＤＮＳ抗细胞增殖能力随时间延长而下降。免疫组化显示受抑制细胞ｍｙｂ水平较同期对照组或正义ＯＤＮｓ组低。以上为反义ＯＤＮｓ抑制外源性生长因子或细胞因子诱导靶基因的高表达和细胞增殖提供了新的线索，同时为探讨癌基因表达调控与动脉ＳＭＣｓ增殖的关系提供了一种新方法。     

反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞周期的阻滞作用

目的: 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞周期的影响. 方法: 大鼠气道平滑肌细胞原代培养后,以Lipofectin将反义、正义和错配c-myc寡核苷酸导入平滑肌细胞,流式细胞技术检测细胞周期,免疫组织化学方法检测cyclin D1和cyclin E的表达. 结果: 反义c-myc寡核苷酸可明显抑制大鼠气道平滑肌细胞通过S期,正义及错配c-myc寡核苷酸对细胞周期无明显影响;反义c-myc寡核苷酸抑制了大鼠气道平滑肌细胞cyclin D1和cyclin E的表达. 结论: 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞通过S期,抑制cyclin D1和cyclin E 的表达.     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。     

阳离子脂质体介导的反应c—myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的：观察阳离子脂质体lipofectAMINE介导的反义c-myb寡核苷酸（LipoAON)对肿瘤生长的影响。方法：取雄性Wistar大鼠48只，行脑内C6胶质瘤接种，术后6天，将携瘤大鼠随机分成LiPoAON组，反义c-myb寡核苷酸组（AON组），阳离子脂质体lipofectAMINE组（Lipo组）和生理盐水对照组（NS组），每组各12只，经大鼠右股静脉给药，间隔1天后，再次用同法经大鼠左股静脉等量给药，给药后严密观察各组大鼠饮食，四肢活动及体重变化情况，并于给药后第4天和第10天每组分别处死6只大鼠，进行肿瘤的生长情况的大体形态学观察。结果：LipoAON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制,c-myb表达下调，而AON组，Lipo组与NS组相比，其肿瘤生长未见抑制现象，c-myb表达亦未见下调，但随着停药时间的延长，LipoAON对肿瘤的抑制作用下降，结论：（1）阳离子脂质体LipofectAMINE作为c-myb AON转移载体，使水溶性c-myb AON容易透过BBTB进入瘤内发挥治疗作用，且具有操作简单，安全，转染率高等特点；（2）LipoAON对C6胶质瘤生长有明显抑制作用，用反义技术抑制c-myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景，（3）LipoAON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降，如何让c-myb AON在瘤内高效，持久，稳定地表达和发挥治疗作用，是值得进一步探讨的课题。     

磷酸胆碱聚合物载反义c—myc寡核苷酸对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄的影响

目的探讨局部转运磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载反义c—myc寡核苷酸（c—mycAS—ODN）基因复合物对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄的影响。方法40只家兔随机分为对照组、多聚赖氨酸（PLL）组、裸c—mycAS—ODN组、PLL载基因复合物N／P=3：1组和N／P=5：1组,每组各8只。构建兔髂动脉球囊损伤模型,于血管损伤段行PLL、c—mycAS—ODN、PLL载N／P=3：1和N／P=5：1基因复合物的局部转运。24h后应用共聚焦显微镜观察基因复合物在髂动脉的分布情况;4周后苏木精-伊红染色光镜下观察髂动脉的组织形态学变化,包括新生内膜面积（NIA）、中膜面积（MA）和新生内膜／中膜面积比（I／M）;Western blot法检测各组损伤血管处c—myc蛋白的表达情况。结果共聚焦显微镜可见转染N／P=3：1、N／P=5：1基因复合物的血管内膜有均匀的绿色荧光分布。苏木精-伊红染色光镜下对照组、PLL组、裸c—mycAS—ODN组均可见显著的内膜增生,组间比较NIA、I／M无显著性差异（P〉0．05）;与对照组比较,N／P=3：1组和N／P=5：1组NIA、I／M均明显减少（P〈0．05）,后两组间比较无显著性差异（P〉0．05）。Western blot显示对照组、PLL组、裸c—mycAS—ODN组c—myc蛋白表达均明显增高,组间比较无显著性差异（P〉0．05）;与对照组比较,N／P=3：1组和N／P=5：1组c—myc蛋白表达明显减少（P〈0．05）,后两组间比较无显著性差异（P〉0．05）。结论多聚赖氨酸可促进MPC30-DEA70／c—myc AS—ODN复合物进入髂动脉血管,有效抑制球囊损伤后新生内膜的过度增生,为基因治疗血管内狭窄提供了新型的非病毒类转基因手段。     

C-myc反义寡核苷酸对肺癌细胞生长增殖及其端粒酶活性抑制作用的观察

目的：探讨硫代磷酸修饰型反义核酸封阻C-myc基因，抑制癌细胞代谢、生长的作用。方法：培养端粒酶高活性的人肺癌细胞系LTEP-a-2，合成针对C-myc基因的硫代反义寡核苷酸封条和随机序列寡核苷酸片断，导入LTEP-a-2细胞系，作用72h，分析反义封条对细胞端粒酶，琥珀酸氧化脱氢酶(SDH)，DNA合成和细胞增殖的作用。结果：C-myc反义封条PS-ODN12 5μmol／L抑制LTEP-a-2细胞34．87％的端粒酶活性；10μmol／L抑制62．71％端粒酶活性；20μmol／L抑制89．18％端粒酶活性。反义封条PS-ODN9 20μmol/L仅抑制LTEP-a-2增殖(39．22％～85．29％)和SDH活性(42％～80％)作用。其对DNA合成亦有抑制作用(71．49％～87．35％)。随机序列硫代修饰寡核苷酸PS-ODN9 20μmol／L仅抑制LTEP-a-2细胞2．37％端粒酶活性，抑制4．5％的细胞增殖和4％SDH活性。结论：C-myc反义封条对肺癌细胞LTEP-a-2的增殖、端粒酶活性有特异性抑制作用，并呈剂量依赖关系。