柯萨奇病毒B3诱导体外培养心肌成纤维细胞增殖与骨桥蛋白表达

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)是小儿常见获得性心脏疾病之一,系病毒感染引起的心肌弥漫性或局灶性病变,近年来VM的发病呈上升趋势[1].目前VM的发病机制尚不十分清楚,病毒可引起心肌细胞发生裂解性溶解、细胞凋亡.近来研究发现变异型柯萨奇病毒B3(myocarditic coxsackievirus B3,CVB3)可通过其他受体进入心肌成纤维细胞[2],进入细胞后的CVB3毒力增加并使细胞呈持续感染状态,产生多种细胞因子,最终导致心肌纤维化、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[3-4].     

存活素蛋白在病毒性心肌炎中的表达及作用

目的探讨病毒性心肌炎(VMC)中存活素蛋白的表达变化及可能机制。方法以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染SD乳鼠原代心肌细胞复制VMC细胞模型,在CVB3感染后0、12、24、36、48、60 h观察心肌细胞形态及搏动情况,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评估心肌细胞损伤程度,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blot技术检测抗凋亡蛋白存活素及凋亡酶cleaved-caspase-3的表达。结果 CVB3感染48 h后,乳鼠原代心肌细胞开始出现团缩变圆,搏动减弱、不规则,至60 h时大部分细胞停止搏动,细胞脱壁、溶解。CVB3病毒感染至细胞凋亡在60 h时至高峰(35.85±3.76)%。感染CVB3后,心肌细胞存活素蛋白表达明显增加,12 h即至最高峰(1.88±0.39),为正常组的1.88倍;随后存活素蛋白表达逐渐减少,60 h时至最低点(0.47±0.41)。CVB3病毒感染激活心肌细胞cleaved-caspase-3表达,60 h时至高峰(3.46±0.16)。心肌细胞存活素蛋白表达量与细胞凋亡率及cleaved-caspase-3表达量均存在显著负相关(r=-0.727、-0.677,P0.01)。结论 VMC时存活素蛋白表达增加,可能在早期参与抗心肌细胞凋亡作用。     

CTLA-4Ig融合蛋白对病毒性心肌炎小鼠Foxp3+调节性T细胞的影响

目的 探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)对柯萨奇B3病毒(CVB3)病毒性心肌炎(VMC)小鼠的病死率、心肌病理改变、病毒复制和心肌组织中Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的影响.方法 106只4 ～ 6周龄健康雄性Balb/c小鼠,体质量为12 ～ 16 g,随机分为CTLA-4Ig组16只、病毒组40只、IgG组40只及正常对照组10只,CTLA-4Ig组、病毒组和IgG组小鼠腹腔注射半数组织细胞感染量(TCID50)为10-3/L的CVB3 0.15 ml,正常对照组小鼠接种0.15 ml不含病毒的Eagle液.CTLA-4Ig组、IgG组小鼠于接种病毒后6、72 h分别注射CTLA-4Ig(0.1 mg/kg)及IgG(0.1 mg/kg).接种病毒后第7天处死所有小鼠在光镜下观察心肌病理变化并计算心肌组织病理积分;采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达;采用免疫组织化学法检测Foxp3分子在心肌组织中的表达,并计算Foxp3+ Tregs所占浸润细胞数的百分率.结果 与病毒对照组相比较,CTLA-4Ig组小鼠病死率降低(80%比50%,P ＜ 0.05),心肌组织病理积分下降(1.78 ± 1.05比1.00 ± 0.72,P ＜ 0.05),心肌CVB3 mRNA表达减少(3.48 ± 2.89比0.81 ± 1.06,P ＜ 0.05);CTLA-4Ig组小鼠心肌组织中Foxp3+ Tregs所占浸润细胞数的百分率较病毒组明显增加(9.22 ± 2.28)% 比(5.42 ± 1.59)%,(P ＜ 0.05).结论 CTLA-4Ig可减轻VMC小鼠心肌炎症,降低心肌病毒复制及病死率,其机制可能与上调Foxp3+ Tregs比、抑制T细胞活化有关.     

骨膜蛋白在实验性病毒性心肌炎小鼠的表达及意义

目的 探讨骨膜蛋白(periostin)在病毒性心肌炎(VMC)中的表达及可能作用.方法 应用柯萨奇病毒B3(CVB3)感染4周龄Balb/c小鼠,建立VMC小鼠模型.100只小鼠分为正常对照组(n ＝ 40)和病毒组(n ＝ 60).在CVB3感染后第0、7、14、28、56天留取标本,测定各实验组不同时间点心肌胶原容积分数(CVF)值(Masson染色)、血清血管紧张素(Ang)Ⅱ水平(ELISA法)、心肌组织中骨膜蛋白和转化生长因子(TGF)β1 mRNA相对表达量(RT-PCR).将骨膜蛋白 mRNA相对表达量与其他指标进行直线相关性分析.结果 VMC组小鼠骨膜蛋白mRNA表达量从病毒感染后第7天开始增加,第28天持续升高,第56天时表达量最高(P ＜ 0.01).骨膜蛋白mRNA表达量与CVF、血清AngⅡ、TGFβ1 mRNA相对表达量均呈直线正相关(r ＝ 0.870 ～ 0.943,P均＜ 0.01).结论 骨膜蛋白的异常表达在VMC的发生、发展中起重要作用,可能参与了VMC心肌纤维化的发生过程.同时骨膜蛋白与AngⅡ及TGF-β1表达相关,可能成为抗VMC心肌纤维化的新靶点.     

病毒性心肌炎发病机制研究的新进展

病毒性心肌炎 (viralmyocarditis,VMC)是儿童后天性心脏病的主要病因 ,是引起儿童心律失常 ,充血性心力衰竭以及猝死的重要原因。本文将近年VMC发病机制的研究新进展综述如下。1　与病毒结合的细胞表面受体的作用1.1　衰变加速因子 (decayacceleratingfactor ,DAF)　DAF是一种柯萨奇病毒B3(coxsackievirusB3,CVB3)的结合受体。由 4条短重复序列 (shortconsensusrepeat ,SCR) ,一个S/T区域和锚定于细胞膜外层的葡萄糖磷酸肌醇 (glyco sylphosphatidylinositol,GPI)构成。CVB3结合于DAF的SCR2 3部位。DAF结合物可以触发酪氨酸…     

巨噬细胞移动抑制因子在病毒性心肌炎小鼠心肌中的表达

目的探讨病毒性心肌炎(VMC)发病过程中心肌组织巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的动态变化及意义。方法70只4周龄雄性BALB/C小鼠腹腔接种0.1ml的coxasckievirusB3(CVB3)建立VMC模型,10只同周龄同品系小鼠腹腔接种Eagle’s液作为对照组。VMC组于接种后第3、7、15、30天随机各取10只处死,对照组于30天处死,采用RT-PCR、免疫组化检测心肌MIFmRNA及蛋白表达,并对MIF表达水平与心肌病变积分进行相关性分析。结果VMC组3～30d各时点心肌MIFmRNA及蛋白表达水平均明显增高,以第7天为最高,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,<0.01),MIF蛋白表达水平与心肌病变积分呈显著正相关(r=0.90,P<0.05)。结论MIF过度表达可能在VMC的发病机制中起重要作用。     

神经生长因子在小鼠病毒性心肌炎心肌中表达的意义

目的探讨病毒性心肌炎(VMC)发病过程中,心肌组织神经生长因子(NGF)表达的动态变化及发病机制中作用。方法70只4周龄雄性BALB/C小鼠腹腔接种0.1ml的CVB3建立VMC模型,10只同周龄同品系小鼠腹腔接种Eagle’s液作为对照组。VMC组于接种后3、7、15、30d,对照组于30d处死,采用RT-PCR、免疫组化检测心肌NGF mRNA及蛋白表达,并对NGF表达水平与心肌病变积分进行相关性分析。结果VMC组3~30d各时点心肌NGF mRNA及蛋白表达水平均明显增高,以7d时为最高,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05或0.01),而且NGF蛋白表达水平与心肌病变积分呈显著正相关(r=0.90,P<0.05)。结论NGF过度表达可能在病毒性心肌炎的发病机制中起重要作用。     

IL-23/IL-17炎症轴在病毒性心肌炎小鼠中的表达及意义

目的观察白介素(IL)-23/IL-17炎症轴在病毒性心肌炎(VMC)小鼠中表达的动态变化,并探讨其意义。方法将60只BALB/c小鼠随机分为VMC组(n=50)和对照组(n=10)。VMC组腹腔注射0.1 ml含柯萨奇B3病毒(CVB3)的Eagle’s液建立VMC模型,分别于接种后第7、14、28天随机各取10只处死;对照组腹腔注射0.1 ml不含CVB3的Eagle’s液,于第28天处死。通过苏木精-伊红(HE)染色检查心肌病理改变,并计算心肌病理积分;采用荧光实时定量PCR、Western blotting检测心肌IL-23及IL-17的mRNA、蛋白表达水平;采用酶联免疫吸附法测定血清IL-23、IL-17浓度;并对VMC组血清IL-23、IL-17浓度与心肌病变积分之间的相关性进行分析。结果 VMC组接种病毒后第7、14、28天心肌病理积分,IL-23和IL-17 mRNA及蛋白表达水平,以及血清IL-23、IL-17水平均高于对照组,差异有统计学意义(P均0.01);其中接种病毒后第7天,VCM组的各项指标均处于最高水平,随后逐渐下降,在各时间点各项指标的差异均有统计学意义(P均0.05);VMC组的血清IL-23、IL-17水平与心肌病理积分呈正相关(r=0.73、0.76,P均0.05)。结论 IL-23/IL-17炎症轴在VMC的发病过程中可能起重要作用,并与VMC病情严重程度密切相关。     

结缔组织生长因子在病毒性心肌炎心肌组织中的变化

目的 观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在病毒性心肌炎( viral myocarditis,VMC)小鼠心肌组织中的表达情况.方法 实验选取BALB/C小鼠100只,分为对照组、VMC组各50只.应用柯萨奇B3病毒(coxsackie virus B3,CVB3)感染小鼠建立VMC模型.在CVB3感染后第4、7、14、21天各随机抽取8只采集心脏标本,行HE染色测定心肌病理积分,应用Masson染色法观察小鼠心肌胶原纤维分布,测量胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF),检测血清CK-MB水平,应用免疫组织化学方法检测转化因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、CTGF蛋白在小鼠心肌中的分布;应用RT-PCR方法检测小鼠心肌组织TGF-β1、CTGF mRNA的相对表达量;并作相关性分析.结果 (1)VMC组小鼠CK-MB水平于第7天达高峰,后逐渐下降(各时间点分别为455.45±37.95,606.95±35.64,573.62±42.90,308.60±20.49),其中第4、7、14天时高于对照组,差异有统计学意义(t值分别为6.144,12.558,11.182,P均＜0.01);(2)VMC组小鼠第14、21天时CVF明显高于对照组(CVF值分别为8.22±1.95,9.46±1.87,t值分别为4.486,5.552,P均＜0.01);(3)免疫组织化学法检测VMC组小鼠各时间点心肌CTGF蛋白(各时间点分别为171.50±10.25,141.70±10.863,110.35±11.051,81.05±10.190)及TGF-β1蛋白(184.90±11.480,150.25±9.915,103.50±10.455,84.15 ±9.848)阳性表达均较对照组高(P均＜0.01);(4)VMC小鼠心肌组织中CTGF mRNA(0.4728±0.0328,0.5750±0.0439,0.6228±0.0458,0.7265±0.0469)及TGF-β1mRNA(0.5757 ±0.0426,0.6922 ±0.0408,0.7447±0.0510,0.8513±0.0505)表达随病毒感染时间延长而增强(P均＜0.01);(5)VMC小鼠心肌组织中CTGF的表达与TGF-β1的表达呈显著正相关(r=0.987,P＜0.01);VMC小鼠心肌组织中CTGF的表达与CVF密切相关(r=-0.901,P＜0.01),但CTGF的表达早于心肌纤维化的出现.结论 CTGF的表达伴随VMC的心肌纤维化程度而增加,提示CTGF的异常表达可能参与了VMC中心肌纤维化的发展过程.     

抗脂质过氧化物对小儿暴发型心肌炎的治疗

有关病毒性心肌炎 (VirusmyocarditisVMC)的发病机制中 ,已认识到活性氧所致脂质过氧化反应 ,对心肌细胞损伤产生重要作用。抗脂质过氧化物成为治疗VMC的主要方法之一。早在上世纪 6 0年代 ,我国用大剂量VitC治疗克山病心源性休克 ,取得良好的效果 ,当时机制不明。 1 985年曹容珍等用大剂量VitC治疗VMC发现 ,外周血红细胞内SOD较治疗前下降 ,疗程后恢复正常 ,提示超氧阴离子与VMC发病机制有一定的关系。苏祖佑等观察到VMC患儿血清LPO含量明显高于同龄健康儿。崔小岱在感染CVB3小鼠细胞模型上观察到 ,病毒感染小鼠心肌细胞导致心…