重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

重组腺病毒抗小鼠移植瘤生长

目的:研究携带细胞因子基因hIL-2、hTNF-a的重组腺病毒对小鼠移植瘤生长抑制作用。方法:将分别携带有hIL-2基因、hTNF-a基因的重组腺病毒感染人肺腺癌Anip973细胞系,应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL-2、TNF-α的分泌量;通过肿瘤局部注射重组腺病毒的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果:转基因的肿瘤细胞生长能力、克隆形成率等无明显变化。24h细胞培养上清IL-2的分泌量为50pg/2×105细胞,TNF-α的分泌量为20pg/2×105细胞。体内实验表明注射重组腺病毒后小鼠肿瘤生长缓慢,体积明显小于对照组(P<0.05),存活期显著延长。结论:瘤内注射重组腺病毒具有明显抗肿瘤作用。     

腺病毒介导人VEGF-siRNA对裸鼠移植骨肉瘤的抑制作用

目的: 研究腺病毒介导人VEGFsiRNA对裸鼠移植骨肉瘤的治疗作用。方法：利用腺病毒重组技术将VEGFsiRNA基因克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中，构建重组腺病毒AdVEGFsiRNA，重组腺病毒体外感染骨肉瘤MG63细胞，RT-PCR检测MG63细胞VEGF的表达水平。建立荷人骨肉瘤MG63裸小鼠动物模型，以Ad-VEGFsiRNA瘤组织注射治疗，检测移植瘤组织中VEGF的表达情况及Ad-VEGFsiRNA对肿瘤生长和肺转移的抑制作用。结果：成功构建了表达VEGFsiRNA的重组腺病毒载体AdVEGFsiRNA；体外与体内实验检测Ad-VEGFsiRNA转染骨肉瘤细胞MG63后显著抑制VEGF表达。荷人骨肉瘤裸鼠经Ad-VEGFsiRNA治疗后，显示其对移植骨肉瘤生长有明显抑制作用（P<0.05），并且对骨肉瘤的肺转移有显著的抑制作用（P<0.05）。结论：所构建的Ad-VEGFsiRNA可以有效抑制骨肉瘤中VEGF表达，使裸鼠移植骨肉瘤生长减慢，并且显著抑制荷瘤裸小鼠肺转移的发生。     

溶瘤腺病毒对肿瘤干细胞的靶向治疗

肿瘤干细胞是肿瘤复发的源泉。溶瘤腺病毒可以选择性地感染并摧毁肿瘤细胞和肿瘤干细胞。文章从溶瘤腺病毒的角度,综述其对肿瘤干细胞的杀伤作用。     

重组腺病毒载体介导人LASS2基因在肝癌细胞转移中的抑制作用

目的:探讨人源性长寿保障基因(homo-sapiens longevity assurance homologue 2 of yeast LAG1,LASS2)对人肝癌HCCLM3细胞体外转移的影响及可能的作用机制.方法:构建含人LASS2基因的重组腺病毒并转染入HCCLM3细胞;采用蛋白质印迹法检测HCCLM3细胞中LASS2蛋白的表达水平;划痕实验及体外侵袭实验检测LASS2基因过表达对HCCLM3细胞在迁移和侵袭等转移能力上的改变;免疫共沉淀法验证LASS2蛋白与V-ATPase(vacuolar H+-ATPase)质子泵中的c亚基(ATP6L)在细胞内相互结合的情况;通过对细胞内外H+浓度的测定,探讨LASS2过表达对V-ATPase功能抑制的情况.结果:成功构建了含人LASS2基因的重组腺病毒,LASS2基因在HCCLM3细胞中能有效表达;LASS2过表达可使HCCLM3细胞的侵袭和迁移能力均明显下降(P＜0.01),其中侵袭能力下降达(48.3±7.6)％,穿过划痕的细胞个数从对照组的(59.00±6.87)个下降至(10.83±3.75)个;LASS2蛋白与ATP6L蛋白在HCCLM3细胞内特异性结合;LASS2过表达后,细胞内外H+浓度发生明显变化,表明V-ATPase质子泵功能受到抑制.结论:LASS2基因在HCCLM3细胞中过表达可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与LASS2蛋白结合ATP6L,抑制其分泌H+功能相关.     

蜂毒素对人肝癌裸鼠移植瘤的抗血管生成作用

目的探讨蜂毒素对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响及其抗血管生成作用。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察蜂毒素对肿瘤生长的影响。采用免疫组织化学法,检测肿瘤组织微血管密度（microvessel density,MVD）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）和核转录因子κB（nuclear factorκB,NF-κB）的水平。结果蜂毒素低、中、高剂量组相对肿瘤增殖率分别为48.78%、38.33%和33.82%。与生理盐水组比较,蜂毒素处理组肿瘤体积明显缩小（P〈0.01）。免疫组化结果显示,蜂毒素可降低肿瘤组织MVD,且蜂毒素处理组bFGF、HIF-1α和NF-κB蛋白水平明显低于生理盐水组（P〈0.01）。结论蜂毒素可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,其作用机制可能是降低NF-κB活性,抑制HIF-1α转录,进而下调bFGF表达,最终阻碍肝癌血管生成。     

重组腺病毒p53基因治疗肝癌研究进展

目的：探讨重组腺病毒p53基因（recombinant humanAd—p53,rAd—p53）治疗肝癌的抗肿瘤机制及临床应用。方法：应用PubMed、万方和CNKI数据库,以“肝癌、重组腺病毒p53基因、基因治疗、实验研究和临床应用”为关键词,检索1994—06—01—2013—11—31文献739篇,纳入标准：1）p53基因与肝癌发生的相关性;2）重组腺病毒p53基因抗肿瘤机制;3）重组腺病毒p53治疗肝癌的实验研究;4）重组腺病毒p53治疗肝癌的临床应用研究。根据纳入标准选择符合分析的文献36篇。结果：p53基因是公认的肿瘤抑制基因,具有促使肿瘤细胞自杀和帮助缺陷细胞修复的作用。rAd—p53是复制缺陷型5型腺病毒载体与人p53基因重组的肿瘤基因治疗制品。rAd-p53通过多种途径发挥抗肿瘤作用,包括使肿瘤的细胞周期阻滞和发生程序性死亡,促进放射线对肿瘤细胞引起的细胞周期阻滞和凋亡,刺激机体产生抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤血管内皮生长因子,控制肿瘤的血管生成,使注射部位瘤组织产生局部血供障碍和坏死。此外,还能增加肝癌细胞的放化疗敏感性,间接增强抗肿瘤疗效。rAd-p53基因疗法为肝癌治疗开辟了崭新的途径,多项-l盘床研究疗效良好。结论：rAd—p53基因对肿瘤的作用机制体现了在抗肿瘤治疗方面的有效性,并在基础研究及临床应用中均取得了显著进展,再肝癌的防治中将取得更大的突破。     

靶向肿瘤血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性抗体的研制

背景与目的:肿瘤的生长依赖于新生血管形成,阻断其血管形成可有效治疗肿瘤.本研究旨在研制抗人肝癌血管内皮细胞的功能性单克隆抗体,确定其抑制人肝癌移植瘤生长的作用.方法:用从新鲜人肝癌组织中分离、鉴定、培养的人肝癌血管内皮细胞免疫10只BALB/c小鼠.免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后采用甲基纤维素选择培养.使用活细胞免疫荧光、细胞增殖、内皮成管实验及"人源化血管"动物模型体内抑瘤实验筛选和鉴定有治疗潜力的功能性抗体.结果:细胞融合产生1 442个单个集落的杂交瘤株,获得119株阳性克隆,其中53株是具有抑制人肝癌血管内皮细胞增殖、成管的功能性抗体,2株被证实能抑制人肝癌移植瘤在BALB/c裸鼠体内的生长,抑瘤率为66.7%～76.5%.结论:建立了高通量制备、筛选、鉴定内皮细胞功能性单抗技术,获得了2株具有靶向血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性单抗.     

hMAM-EP调控HSV-TK腺病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞的靶向杀伤

目的:分别构建人乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)基因增强子和启动子(enhancer and promoter of hMAM,hMAM-EP)调控的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simple virus thymidine kinase,HSV-TK)自杀基因两种重组腺病毒载体,探讨hMAM-EP调控的HSV-TK在乳腺癌细胞特异性表达及其对乳腺癌的靶向治疗作用.方法:构建hMAM-EP-EGFP和hMAM-EP-TK重组质粒载体,将重组质粒目的基因转移到腺病毒骨架黏粒载体pAxcwit2,并转染HEK 293细胞获得重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK.将Ad-EP-EGFP感染乳腺癌细胞T-47D、ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F,荧光显微镜观察EGFP的表达.将Ad-EP-TK感染T47D细胞,给予1、10、20、50 μg/ml前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV),观察TK基因对乳腺癌细胞的特异杀伤作用.结果:成功构建hMAM-EP调控的重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK.Ad-EP-EGFP感染后,乳腺癌T-47D细胞可见EGFP表达,但ZR-75-30细胞和5-SF细胞无表达.与未感染组或感染Ad-EP-EGFP组相比,Ad-EP-TK重组腺病毒联合GCV(50 μg/ml)组T-47D细胞存活率显著降低[(35.69±0.07)％vs (91.74±0.02)％,(87.69 ±0.11)％;P ＜0.05],且随GCV质量浓度的增加,T-47D细胞存活率逐渐下降,在MOI=100、GCV质量浓度分别为1、10、20、50 μg/ml条件下,细胞存活率分别为(94.34 ±0.04)％、(86.26 ±0.02)％、(66.51±0.09)％、(35.69±0.07)％.结论:hMAM-EP调控的HSV-TK自杀基因在乳腺癌T-47D细胞中特异性表达,Ad-EP-TK联合GCV可靶向杀伤乳腺癌T-47D细胞.     

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统联合放射治疗口腔鳞癌的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）／丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统对放射治疗的增敏作用。方法 口腔鳞癌细胞（Tca8113细胞系）经HSV－TK／GCV系统治疗后给予放射治疗，采用LQ和单击多靶（SHMT）模型分析细胞存活曲线参数。结果 细胞存活曲线分析显示：单纯放射治疗组其α为0.1074,β为0.0158,D0为2.2576,Dq为3.5413；与单纯放射治疗组比较，HSV－TK／GCV治疗组α（0.2127)和α：β（9.496)值大，D0（1.4526)和Dq(2.2257)值小，其放射增敏率（SER）为1.55。结论 HSV－TK／GCV系统具有放射增敏作用，可提高放射治疗对口腔鳞癌的治疗疗效。     

重组腺病毒胸苷激酶基因构建体联合更昔洛韦治疗移植瘤裸鼠小细胞肺癌的实验研究

目的　观察以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组构建体 (ADV TK)联合更昔洛韦 (GCV)体内抗肺癌的活性。方法　建立移植瘤裸鼠小细胞肺癌模型 ,肺癌局部注射ADV TK后 ,腹腔注射GCV ,观察肿瘤体积、相对肿瘤体积、瘤重、相对肿瘤增殖率以及肿瘤体积生长变化的时间曲线 ,评价ADV TK的抗肿瘤活性。结果　在作用底物GCV存在条件下 ,ADV TK对人癌裸鼠移植性小细胞肺癌生长具有明显抑制作用 ,对裸鼠移植性小细胞肺癌的体积和瘤重的抑制效应与ADV TK呈剂量依赖性增强 ,且未达量效平台期 ,其中 6 .0× 10 9病毒颗粒 /kg剂量组的肿瘤生长抑制率分别达到 6 4 .6 %和 81.7%。将ADV TK和GCV分别单独应用 ,结果显示对肿瘤生长均有一定的抑制作用 ,但与阴性对照组相比 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　ADV TK联合GCV对肺癌具有明确的实验性治疗作用 ,值得进一步研究 ,开展临床试验。     

重组腺病毒-胸苷激酶基因对多种肿瘤细胞的杀伤作用

背景与目的:以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(adenovirusvector-mediatedherpessimplexvirus-thymidinekinasegene,ADV-TK)重组体是肿瘤基因治疗应用的主要方法之一,本文旨在鉴定自行构建的ADV-TK重组体的体外抗肿瘤活性。方法:利用腺病毒载体将TK导入体外培养的14种不同组织源性的肿瘤细胞,再加入更昔洛韦(ganciclovir,GCV),用MTT法观察对肿瘤细胞的抑制效应。结果:ADV-TK剂量为每孔1×109病毒颗粒,在100μg/mlGCV底物浓度条件下,它对14种肿瘤细胞中的11种杀伤率达74%以上,而对人喉上皮癌细胞Hep-2、人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8敏感性稍差,分别为(55.3±2.0)%、(61.3±2.0)%和(63.7±2.5)%,ADV-TK对肿瘤细胞的抑制率除人喉上皮癌细胞Hep-2外,与相当于组织峰值药物浓度(5μg/ml)的化疗药物顺铂的效率相近。结论:ADV-TK重组体具有明确的体外抗肿瘤活性,有潜在临床应用价值。     

阳离子脂质体介导的HSV-tk自杀基因疗法的体内外抗肝癌作用

为研究阳离子脂质体介导HSV-tk自杀基因系统的体内外抗肝癌作用,本课题用基因重组技术构建了含HSV-tk基因的重组逆转录病毒载体,命名为pLXT。用Lipofectin介导转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选抗性克隆及流式细胞仪分析,获得了持续表达HSV-tk的克隆细胞SM/tk。~3H-TdR掺入法测定表明HSV-tk/ACV系统对SM/tk细胞具有强杀伤力。将Lipofectin-pLXT复合物直接注射于鼠肝癌细胞(H22)实体瘤内,ACV治疗后监测抑瘤率,发现脂质体介导pLXT、ACV治疗组及裸pLXT注射、ACV治疗组平均瘤体积均显著小于其它六组对照组(P<0.001,P<0.05),前两者比较亦有显著差异(P<0.02)。空载体转染组和阴性对照组平均瘤体积及平均瘤重均无显著差异(P>0.05)。这些结果表明阳离子脂质体介导重组逆转录病毒载体基因转染的方法简便、安全、有效,且可使目的基因获得持续表达;在体内HSV-tk/ACV系统具有强的细胞毒作用,提示存在着强的旁观者效应。此外,瘤体内直接注射裸HSV-tk基因的治疗也有效。     

重组腺病毒介导自杀基因HSV1-tk转染内皮祖细胞的实验研究

[目的]构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸腺激酶基因( HSV1-tk)的重组腺病毒载体,并感染大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs),以期用于抗肿瘤血管生成的基因治疗及核素报告基因显像.[方法]从大鼠骨髓中分离、培养EPCs,利用流式细胞术进行鉴定.构建重组腺病毒载体Ad5-HSV1-tk-EGFP,并感染EPCs,以腺病毒Ad5-EGFP为对照.利用RT-PCR法、Westernblot免疫印迹法检测HSV1-tk的表达,利用MTT法检测更昔洛韦(GCV)对病毒感染后EPCs的杀伤作用.[结果]流式细胞术结果显示从大鼠骨髓中分离出的EPCs阳性表达CD34(80.09％)和CD 133(81.75％),RT-PCR及Western blot免疫印迹结果显示HSV1-tk基因在转录及蛋白水平可以正确表达,MTT结果显示HSV-tk/GCV自杀基因系统对EPCs细胞具有明显的杀伤作用.[结论]重组腺病毒Ad5-HSV1-tk-EGFP感染EPCs后可以在细胞中成功表达,并且感染后自杀基因具有生物学活性,从而为利用EPCs作为载体进行肿瘤靶向基因治疗、报告基因显像提供实验依据.     

重组腺病毒介导survivin基因转染树突状细胞对肾细胞癌的免疫效应

目的:研究重组腺病毒介导survivin基因转染的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性抗肾细胞癌的免疫效应.方法:以携带survivin基因的重组腺病毒(Ad-svv)感染DCs, Western bloting检测转染DCs的survivin的表达,流式细胞术检测DCs表面分子CD83、MHCⅡ、CD80、CD86的表达,ELISA法检测DCs培养上清中IL-12 的含量;混合淋巴细胞反应(MLR)测定DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力, ELISA法检测DCs刺激淋巴细胞后上清中IFN-γ含量,MTT法检测其诱导的特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)免疫效应.结果:各组Ad-svv转染DCs后均表现出成熟的DCs表型特征,均可见survivin蛋白表达;转染Ad-svv或转染空白腺病毒载体(Ad-CMV)的DCs上清中IL-12均高于对照组(P<0.01),转染Ad-svv的DCs上清中IL-12高于转染Ad-CMV-DCs组(P<0.01).MLR中,转染或未转染腺病毒的DCs均能刺激同种异体T淋巴细胞的增殖,Ad-svv-DC刺激T淋巴细胞增殖的能力最强(P<0.01);MLR后,转染或未转染重组腺病毒的DCs均能刺激T淋巴细胞IFN-γ的分泌,Ad-svv-DC组IFN-γ的分泌能力最强(P<0.01).Ad-svv-DCs组诱导的CTL对survivin表达阳性的786-0肾癌细胞的杀伤率明显高于无survivin表达的L-02肝细胞(P<0.01),Ad-CMV-DCs、空白DC对786-0肾癌细胞无杀伤作用.结论:重组腺病毒介导survivin基因转染能显著提高DCs对肾癌细胞抗原的提呈能力、激活特异性细胞毒性T淋巴细胞、诱导针对survivin的特异性抗癌免疫效应.     

Inducible expression of herpes simplex virus thymidine kinase increases sensitivity to ganciclovir but does not enhance bystander effect in breast cancer cells

Delivery of cancer chemotherapy directly to the cancer cell has great appeal. Previous studies using adenoviral transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene followed by ganciclovir (GCV) in an ascites model of breast cancer was successful in reducing tumor burden and prolonging life. However, increasing the viral dose resulted in increased toxicity and host mortality emphasizing the need for an improved therapeutic ratio. To test the hypothesis that enhancement of HSV-tk gene expression would lead to increased sensitivity to GCV and improved bystander effect, we created breast cancer cells expressing HSV-tk under the control of the inducible tetracycline promoter. Using this system, we could inducibly increase gene expression and biochemical activation of HSV-tk. These increased levels of HSV-tk decreased the IC₅₀ to GCV nearly 50-fold. However, the bystander effect was not enhanced by increasing HSV-tk gene expression. We conclude that increased HSV-tk gene expression improves sensitivity to CCV. However, additional measures, such as increased gap junction communication, will likely be needed to enhance the bystander effect and the therapeutic efficacy of this strategy.     

Polyamine biosynthesis inhibition enhances HSV-1 thymidine kinase/ganciclovir-mediated cytotoxicity in tumor cells

Cancer gene therapy with the aid of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene (HSV-TK) and anti-herpes drug ganciclovir (GCV) has been widely used and its efficacy has been demonstrated in a variety of different malignant cells and animal tumor models. It is also commonly accepted, however, that this gene therapy regimen needs to be enhanced for a true clinical success. We studied whether polyamine biosynthesis inhibition by 2-difluoromethylornithine (DFMO), a clinically tested and well-tolerated chemotherapeutic drug, can increase the cytotoxicity of HSV-TK/GCV in 9L rat glioma cells. Our initial experiments showed that polyamine depletion actually protected the cells from cytotoxicity if GCV treatment was started too early after removal of DFMO. Analyses of cell growth, intracellular polyamine pools and cell cycle phase distribution suggested that later initiation of GCV treatment would be more beneficial due to increased proportion of cells in the middle of the cell cycle S phase. When the cells were exposed to GCV 3 or 4 days after removal of DFMO from growth medium, the cytotoxicity was increased up to 2.5-fold. We also verified whether cell cycle blockage per se could yield similar effect as DFMO. Our results from serum deprivation experiments showed that, despite of apparent cell growth and cell cycle phase distribution effects, serum starvation was weaker enhancer of HSV-TK/GCV cytotoxicity than DFMO. Finally, the general utility of HSV-TK/GCV + DFMO combination was tested in another tumor cell type, human prostate carcinoma cell line DU-145. DFMO sensitized these cells to HSV-TK/GCV cytotoxicity, but the effect was less prominent than in 9L cells. In conclusion, we have demonstrated that a correctly timed induction of DFMO-mediated polyamine biosynthesis inhibition can enhance the efficiency of HSV-TK/GCV gene therapy in vitro. The observed synergistic effect is potentially useful in clinical trials because, as opposed to use of other cell cycle-altering drugs, DFMO has already been tested in the treatment of human tumors and used as chemo preventive regimen with excellent tolerability.