γ射线联合HSV-tk/GCV基因治疗系统抗肿瘤体外实验研究

目的研究γ射线与人单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统联合应用对Lewis肺癌细胞的杀伤作用及其可能机制。方法以脂质体介导法将含HSV—tk基因的真核表达质粒体外转染小鼠Lewis肺癌细胞，建立稳定表达的细胞株；RT-PCR检测细胞tk基因表达；Hoechst33258/PI荧光活染、流式细胞术检测γ射线与HSV-tk／GCV系统单独及联合作用下的细胞凋亡；集落形成法检测细胞存活曲线，反映放射敏感性变化；同时检测旁观者效应及γ射线对该效应的影响。结果HSV-tk／GCV系统对转染基因的Lewis细胞（Lewis-Hytk细胞）具有选择性杀伤作用。γ射线与HSV-tk／GCV系统联合应用可使Lewis-Hytk细胞的凋亡和坏死率显著高于二者单独作用之和。0．1μg/ml GCV可使Lewis-Hytk细胞的放射敏感性明显增高（SER=1．47）。γ射线可增强HSV-tk/GCV系统的旁观者效应，二者联合作用后的Lewis-Hytk细胞的培养液对未处理过的Lewis细胞具有杀伤作用。结论γ射线与HSV-tk／GCV系统联合应用对Lewis肺癌细胞具有协同杀伤效应。γ射线增强HSV—tk／GCV系统的旁观者效应可能是其协同效应产生的机制之一．     

HSV-TK基因靶向治疗与放射治疗联合应用的研究进展

自杀基因疗法(suicide gene therapy)又称为酶药物前体法(enzyme prodrug therapy),自1986年首次报道单纯疱疹病胸苷激酶(herpeslsimplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)因可提高抗病毒药物更昔洛韦(gancyclovir,GCV)对肿瘤细的杀伤敏感性后,自杀基因疗法就成为众多研究者争先探索焦点。HSV-TK/GCV目前是研究最深入、最具有应用前景自杀基因治疗系统,现已广泛用于各种恶性肿瘤的治疗,本就HSV-TK/GCV自杀基因系统的靶向治疗和与放射治疗联合应用的研究进展作一综述。     

重组腺病毒mIκBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察

目的 探讨重组腺病毒mIkBα基因（AdmIkBα）联合γ射线对人高转移性肝细胞癌HCC9204细胞和裸鼠HCC9204移植瘤生长的影响。方法利用有限稀释法测定病毒滴度，以不同感染复数（MOI）的AdIxBαm（10、20、30、50）转染HCC9204细胞，Westemblotting法检测转染前后细胞1：）65表达和mIxBa表达。采用4Gyγ射线对各组细胞进行治疗。MTT法检测转染组、转染组＋放射组、对照组细胞生长抑制率。建立裸鼠HCC9204肝癌动物模型，肿瘤局部注射AdmIkBα30MOI并联合6Gyy射线治疗，在不同时间测量肿瘤体积。结果病毒滴度1．252×10^9pfu／ml。mIkBa蛋白随AdmlteBa剂量增加而进行性增加，P65蛋白随AdmIkBα剂量的增加呈进行性递减。转染组体外细胞生长随AdmIkBα剂量的增加逐渐受抑制，经7射线照射后生长抑制更加明显。AdmIkBα转染和放射联合治疗后7～28d，裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染治疗组。结论AdmIkBα转染联合Y射线治疗可增强对肝痛细胞杀灭作用．联合治疗明品优于单纯放疗组和单纯基因治疗组。     

60Coγ辐射诱导下IL-6对人多发性骨髓瘤细胞株凋亡效应的实验研究

目的研究白介素-6(IL-6)在60Coγ辐射诱导人多发性骨髓瘤细胞株XG-6、XG-7凋亡效应中的作用及其可能的分子生物学机理.方法运用流式细胞仪技术(FACS)、DNA片段释放法和RT-PCR,观察了IL-6对细胞株XG-6、XG-7中Bcl-xL、BaxmRNA相对表达的影响及其与辐照诱导的细胞凋亡率的相关性.结果IL-6存在时,XG-6、XG-7细胞的Bcl-xL、BaxmRNA表达在辐照后迅速上升,4h达最高峰后逐渐下降,24～48h恢复到照射前水平;不加IL-6的XG-6、XG-7细胞的Bcl-xL的表达在同样实验条件未检测到,而这2株细胞BaxmRNA的表达在照射后不同时间均低于相应的加IL-6组,但尚有明显的表达.对不加IL-6的细胞组,辐照后不同时间的凋亡率明显高于相应的加IL-6组(P＜0.05).结论IL-6可通过调节Bcl-xL、Bax的表达及改变BcL-xL/Bax二者比率,保护辐照诱导XG-6、XG-7的细胞凋亡.     

60Co γ射线诱导人淋巴细胞线粒体基因表达效应的研究

目的 探讨电离辐射诱导正常人B淋巴细胞线粒体辐射敏感基因mRNA水平的剂量-效应关系。 方法 用0、0.5、1、3、5、8、10和15 Gy ⁶⁰Co γ射线分别照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,24 h后用反转录PCR和实时荧光定量PCR方法检测7个相对辐射敏感基因,包括ND3、Cyt b、COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、ATPase6和ATPase8基因mRNA的表达水平,观察其剂量-效应关系。 结果 ⁶⁰Co γ射线照射后24 h,线粒体7个辐射敏感基因表达总体上调。线粒体呼吸链复合体Ⅳ亚基Ⅰ(COXⅠ)基因表达在受到8 Gy照射后增强最明显,为对照组的13倍左右。除COXⅠ和COXⅡ外,其余5个基因在受照后表现出一定的剂量-效应关系。其中,ND3、ATPase6和ATPase8这3个基因在3~15 Gy的范围内线性关系良好,而COXⅢ基因在3~10 Gy的范围内也有十分良好的线性关系。结论 ⁶⁰Co γ射线照射后24 h,线粒体基因表达水平总体上调,其中ND3、ATPase6、ATPase8和COXⅢ这4个基因在一定剂量范围内线性关系良好,可以作为联合辐射损伤生物标志物进一步研究。     

Non-invasive in vivo imaging with radiolabelled FIAU for monitoring cancer gene therapy using herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and ganciclovir

An experimental cancer gene therapy model was employed to develop a non-invasive imaging procedure using radiolabelled 2'-fluoro-2'-deoxy-5-iodo-1--d-arabinofuranosyluracil (FIAU) as an enzyme substrate for monitoring retroviral vector-mediated herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene (HSV1-tk) transgene expression. Iodine-131 labelled FIAU was prepared by a no-carrier-added (n.c.a.) synthesis process and lyophilised to give "hot kits". The labelling yield was over 95%, with a radiochemical purity of more than 98%. The stability of [¹³¹I]FIAU in the form of lyophilised powder (the hot kit) was much better than that in the normal saline solution. The shelf life of the final [¹³¹I]FIAU hot kit product is as long as 4 weeks. Cellular uptake of [¹³¹I]FIAU after different periods of storage was investigated in vitro with HSV1-tk-retroviral vector transduced NG4TL4-STK and parental non-transduced NG4TL4 murine sarcoma cell lines over an 8-h incubation period. The NG4TL4-STK cells accumulated more radioactivity than NG4TL4 cells in all conditions, and accumulation increased with time up to 8 h. The kinetic profile of the cellular uptake of n.c.a. [¹³¹I]FIAU formulated from the lyophilised hot kit or from the stock solution was qualitatively similar. For animal model cancer gene therapy studies, FVB/N mice were inoculated subcutaneously with the HSV1-tk(+) and tk(–) sarcoma cells into the flank to produce tumours. Biodistribution studies showed that tumour/blood ratios were 2, 3.5, 8.2 and 386.8 at 1, 4, 8 and 24 h post injection, respectively, for the HSV1-tk(+) tumours, and 0.5, 0.5, 0.7 and 5.4, respectively, for the HSV1-tk(–) tumours. Radiotracer clearance from blood was completed in 24 h and was bi-exponential. A significant difference in radioactivity accumulation was revealed among the HSV1-tk(+) tumours, the tk(–) tumours and other tissues. At 24 h p.i., higher activity retention was observed in HSV1-tk(+) tumours (9.67%±3.89%ID/g) than in HSV1-tk(–) tumours (0.48%±0.19%ID/g). After seven consecutive daily treatments with the prodrug ganciclovir, planar gamma camera imaging showed HSV1-tk(+) tumour regression at day 4, and complete tumour regression at day 7. These results clearly demonstrate that the simplified n.c.a. synthesis process developed in this study is reliable and that the [¹³¹I]FIAU product is useful for in vivo monitoring of HSV1-tk gene transfer, expression and gene therapy.     

局部放疗联合89Sr治疗骨转移癌的疗效观察

目的评价局部放疗配合放射性核素^89Sr治疗骨转移癌的疗放，分析单纯放疗单纯核素^89Sr治疗及联合治疗的副作用。方法观察60例确诊为骨转移癌的患者，分为3组，每组20例。局部放疗（A组），采用6MV直线加速器外照射给予吸收剂量30—60Gy，2—4周，局部放疗＋^89Sr治疗（B组），单纯^89Sr治疗（C组）放射性核素^89Sr静脉内注射3—4mCi。结果治疗后B组骨痛缓解，原发灶改善明显好于A、C组；新增疼痛部位及转移灶均少于A、C组（P〈0．05）。治疗后血液学的毒性3组差异统计学意义（P〉0．05）。结论局部放疗配合^89Sr治疗骨转移癌有较好的疗效，提示对单发性骨转移患者的压痛明显部位给予局部外照射止痛效果明显，对多发骨转移且病灶相距较近的给予放疗联合^89Sr治疗效果安全可靠，对全身性多发性骨转移者采用单纯放射性核素^89Sr治疗对于止痛和控制骨转移有一定疗效。     

核素125I标记hTERT/PSA启动子双调控溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗及肿瘤微环境的影响

目的 探究¹²⁵I-RSOAds-hTERT/PSA溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗作用以及对肿瘤微环境的影响。方法 采用PCR扩增技术及双酶切连接技术构建¹²⁵I-RSOAds-hTERT/PSA溶瘤腺病毒（¹²⁵I-病毒复合物）。通过缺口末端标记法（TUNEL）染色,流式细胞实验以及Caspase-3的免疫印迹实验分别从体内和体外检测¹²⁵I-病毒复合物对前列腺癌细胞的杀伤作用。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测人前列腺癌细胞株PC3和小鼠前列腺癌细胞株RM-1培养上清液及血清中的白介素2（IL-2）、IL-10、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）等的分泌水平,探究¹²⁵I-病毒复合物对瘤组织细胞因子分泌水平的影响。通过免疫组织化学法以及免疫荧光实验探究¹²⁵I-病毒复合物对前列腺癌组织及癌细胞中CD24、CD44以及前列腺干细胞抗原（PSCA）表达的调节,同时检测瘤组织中CD32和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平,以及CD4+、CD8+和巨噬细胞浸润情况。结果 ¹²⁵I-病毒复合物体内、体外均可显著诱导癌细胞凋亡,同时显著高于¹²⁵I组和病毒复合物组。同时IL-2（t=-183.30、-38.20,P<0.05）、IL-10（t=113.80、92.71,P<0.05）、TNF-α（t=-73.20、-73.91,P<0.05）、IFN-γ（t=-65.37、-139.70,P<0.05）在体内体外含量均升高。¹²⁵I-病毒复合物可降低癌细胞及癌组织中CD24、CD44以及PSCA表达,减小癌组织重量（t=8.55,P<0.05）,抑制癌组织血管生成,同时调节肿瘤组织中免疫反应。结论 ¹²⁵I-病毒复合物溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向可显著杀伤癌细胞,减少癌组织重量和血管生成,同时改善肿瘤微环境。     

177Lu-FA-DOTA-PEG-PLGA靶向可降解纳米粒子腹腔灌注治疗小鼠卵巢癌伴腹膜转移的实验研究

目的 观察放射性核素¹⁷⁷Lu标记的叶酸-二乙烯三胺五乙酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物(¹⁷⁷Lu-FA-DOTA-PEG-PLGA)纳米粒子的体内靶向分布,评价腹腔灌注纳米粒子治疗小鼠卵巢癌腹膜转移瘤及腹水疗效。方法 制备¹⁷⁷Lu-FA-DOTA-PEG-PLGA纳米粒子,向人卵巢癌移植瘤荷瘤小鼠尾静脉注射纳米粒子后4、24、72 h和7 d,行微型单光子发射计算机断层显像仪(micro-SPECT/CT)显像,观察纳米粒子体内分布情况。将12只人卵巢癌腹腔转移瘤裸鼠模型按随机抽签法分为阴性对照组(生理盐水)、化疗组(顺铂3 mg/kg,2次/周)和粒子组(¹⁷⁷Lu-FA-DOTA-PEG-PLGA粒子18.5 MBq),每组4只,腹腔灌注给药。7 d后行活体荧光成像评价腹腔肿瘤生长情况,计算相对抑瘤率,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率,免疫组织化学法检测肿瘤Ki67增殖活性,比较治疗后各组腹水体积。结果 micro-SPECT/CT显像显示,移植瘤放射性浓聚,24 h肿瘤肌肉摄取比值(T/M)最高,为2.81±0.49。活体荧光成像显示,腹腔给药治疗后,粒子组、化疗组和阴性对照组的腹腔肿瘤荧光强度分别为(1.45±0.19)×10¹⁰、(2.21±0.36)×10¹⁰和(2.63±0.79)×10¹⁰,差异有统计学意义(F=6.09,P=0.029);粒子组和化疗组的相对肿瘤抑制率(TGI)分别为35.6%和18.6%。粒子组和化疗组的肿瘤细胞凋亡率(AI)均高于阴性对照组(F=9.96,P=0.009),粒子组和化疗组的Ki67指数均低于阴性对照组(F=9.93,P=0.013),粒子组和化疗组腹水体积均小于阴性对照组(F=13.43,P=0.006)。结论 ¹⁷⁷Lu-FA-DOTA-PEG-PLGA纳米粒子可行小鼠卵巢癌靶向显像,腹腔灌注后局部滞留和降解吸收,抑制卵巢癌腹膜转移瘤和腹水生长,为晚期卵巢癌伴腹膜转移患者诊疗提供新思路。