HSV-TK基因靶向治疗与放射治疗联合应用的研究进展

自杀基因疗法(suicide gene therapy)又称为酶药物前体法(enzyme prodrug therapy),自1986年首次报道单纯疱疹病胸苷激酶(herpeslsimplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)因可提高抗病毒药物更昔洛韦(gancyclovir,GCV)对肿瘤细的杀伤敏感性后,自杀基因疗法就成为众多研究者争先探索焦点。HSV-TK/GCV目前是研究最深入、最具有应用前景自杀基因治疗系统,现已广泛用于各种恶性肿瘤的治疗,本就HSV-TK/GCV自杀基因系统的靶向治疗和与放射治疗联合应用的研究进展作一综述。     

甘氨双唑钠对肺癌体内外放射增敏作用研究

目的研究甘氨双唑钠对肺癌细胞株照射敏感性及配合肺癌患者应用γ刀治疗的放射增敏作用。方法肺癌细胞系NCl—H446和NCl—H596用^60Coγ射线照射，同时用或不用甘氨双唑钠配合，台盼蓝拒染法检测存活细胞存活率；绘制细胞生存曲线；应用γ刀治疗的临床各期肺癌患者，治疗前静脉滴注甘氨双唑钠，同时随机选择单纯γ刀治疗未使用甘氨双唑钠者作为对照。1个疗程结束后6周评价疗效。结果甘氨双唑钠可以显著增加肺癌细胞株对γ射线的敏感性，提高γ射线对肺癌细胞系的杀伤作用；甘氨双唑钠配合γ刀治疗肺癌可显著增加疗效，两组总有效率（CR＋PR）分别为47．22％和37．67％，抑瘤率分别为55．42％和44．15％，差异有统计学意义（P〈0．05），且与临床分期及病理类型无关（P〉0．05）。结论甘氨双唑钠对肺癌细胞株及肺癌患者的放射治疗有增敏作用，能显著提高放疗疗效，是一种良好的放射增敏剂。     

内皮抑素基因联合放射治疗对大鼠Walker-256细胞种植性肿瘤的抑制作用

目的探讨鼠源性内皮抑素（endostatin）基因联合放射治疗对大鼠种植性肿瘤的抑制效应。方法制作大鼠乳腺癌Walker-256细胞种植性肿瘤的动物模型，通过检测肿瘤重量和肿瘤生长速率观察内皮抑素基因治疗联合放疗的抑瘤效应。体外采用Western blot检测构建pCMV-endostatin质粒转染的Walke-256细胞endostatin蛋白表达，体内采用BT-PCR观察各组endostatin mRNA表达。结果基因治疗组和基因治疗联合放射治疗组均可见到endostatin mRNA及其蛋白明显表达，但两组间表达无统计学意义；基因与放射联合组肿瘤的生长速率和重量均明显小于单纯基因治疗和放疗组（P〈0．01），后两组其肿瘤的生长速率和重量明显低于对照组（P〈0．01），但二者之间差异无统计学意义。结论pCMV-endostatin在Walker-256细胞内有明显表达endostatin mRNA及其蛋白；endostatin基因治疗有明显的抑瘤作用，但endostatin基因联合放疗的抑瘤效应更明显，促进放疗的抑瘤效果。     

重组腺病毒mIκBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察

目的 探讨重组腺病毒mIkBα基因（AdmIkBα）联合γ射线对人高转移性肝细胞癌HCC9204细胞和裸鼠HCC9204移植瘤生长的影响。方法利用有限稀释法测定病毒滴度，以不同感染复数（MOI）的AdIxBαm（10、20、30、50）转染HCC9204细胞，Westemblotting法检测转染前后细胞1：）65表达和mIxBa表达。采用4Gyγ射线对各组细胞进行治疗。MTT法检测转染组、转染组＋放射组、对照组细胞生长抑制率。建立裸鼠HCC9204肝癌动物模型，肿瘤局部注射AdmIkBα30MOI并联合6Gyy射线治疗，在不同时间测量肿瘤体积。结果病毒滴度1．252×10^9pfu／ml。mIkBa蛋白随AdmlteBa剂量增加而进行性增加，P65蛋白随AdmIkBα剂量的增加呈进行性递减。转染组体外细胞生长随AdmIkBα剂量的增加逐渐受抑制，经7射线照射后生长抑制更加明显。AdmIkBα转染和放射联合治疗后7～28d，裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染治疗组。结论AdmIkBα转染联合Y射线治疗可增强对肝痛细胞杀灭作用．联合治疗明品优于单纯放疗组和单纯基因治疗组。     

三维适形放疗加甘氨双唑钠增敏治疗食管癌疗效观察

目的：观察三维适形放疗加甘氨双唑钠增敏治疗食管癌的疗效。方法：将食管癌98例分为单纯放疗组（A组）52例，照射剂量2.0Gy／次，5次／周，总量66-70Gy；增敏放疗组（B组）46例，在A组放疗基础上，静脉滴注甘氨双唑钠800mg／m^2，每周3次，连续用药至放疗结束。结果：A组有效率及1年生存率分别为73％和48％，明显低于B组（96％，86％）。结论：甘氨双唑钠对食管癌放疗有增敏作用，可提高食管癌的部分缓解率和1年生存率。     

γ射线联合HSV-tk/GCV基因治疗系统抗肿瘤体外实验研究

目的研究γ射线与人单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统联合应用对Lewis肺癌细胞的杀伤作用及其可能机制。方法以脂质体介导法将含HSV—tk基因的真核表达质粒体外转染小鼠Lewis肺癌细胞，建立稳定表达的细胞株；RT-PCR检测细胞tk基因表达；Hoechst33258/PI荧光活染、流式细胞术检测γ射线与HSV-tk／GCV系统单独及联合作用下的细胞凋亡；集落形成法检测细胞存活曲线，反映放射敏感性变化；同时检测旁观者效应及γ射线对该效应的影响。结果HSV-tk／GCV系统对转染基因的Lewis细胞（Lewis-Hytk细胞）具有选择性杀伤作用。γ射线与HSV-tk／GCV系统联合应用可使Lewis-Hytk细胞的凋亡和坏死率显著高于二者单独作用之和。0．1μg/ml GCV可使Lewis-Hytk细胞的放射敏感性明显增高（SER=1．47）。γ射线可增强HSV-tk/GCV系统的旁观者效应，二者联合作用后的Lewis-Hytk细胞的培养液对未处理过的Lewis细胞具有杀伤作用。结论γ射线与HSV-tk／GCV系统联合应用对Lewis肺癌细胞具有协同杀伤效应。γ射线增强HSV—tk／GCV系统的旁观者效应可能是其协同效应产生的机制之一．     

碳离子放疗与化疗药物联合应用的生物学效应

碳离子放射治疗（carbon ion radiotherapy,CIRT）属于高线性能量传递（higher linear energy transfer,LET）射线。碳离子射线不但具有适合肿瘤放射治疗的物理剂量分布特征（Bragg峰）,而且主要通过导致肿瘤细胞DNA的双链断裂杀灭肿瘤细胞,因此较光子射线具更强的生物学效应,对肿瘤细胞具有更强的杀灭作用。化疗药物与光子放射治疗的联合治疗是目前广泛应用于肿瘤治疗的策略。化疗与放疗的同期应用主要基于其增敏作用。然而,化疗药物是否能增敏碳离子放疗的抗肿瘤效应而不仅仅是叠加效应,目前尚未明确。本文将基于对基础生物学研究（包括细胞学实验及动物实验）到临床研究结果的分析,详细阐述肿瘤碳离子放疗与化疗药物联合治疗的生物学效应。     

三氧化二砷对鼻咽癌放射增敏的临床研究

目的探讨三氧化二砷对鼻咽癌放射增敏作用临床应用的价值。方法将61例T1-4 N0-1期鼻咽癌病人随机分入单纯放疗组和三氧化二砷放射增敏组，观察两组病人鼻咽肿瘤和颈部肿瘤消退情况及毒副作用。结果放射治疗40Gy时三氧化二砷增敏组和单纯放疗组的鼻咽肿瘤消退率分别为53．13％（17／32）和17．24％（5／29），χ^2=8．495，P=0．004，差异有统计学意义；两组的颈部肿块消退速度无差别；三氧化二砷增敏组的白细胞降低和恶心呕吐较单纯放疗组发生频率高，但多为Ⅰ～Ⅱ度反应，未见Ⅳ度反应。其他的不良反应在两组间差异无统计学意义。结论与单纯放疗相比，放疗加三氧化二砷使鼻咽肿瘤消退较快，无严重毒副作用。     

卡莫氟对骨转移癌的放射增敏的临床研究

在骨转移癌治疗中化疗药物作为放疗增敏的临床研究少见，我们对126例临床确诊的骨转移癌病人随机分组应用卡莫氟（HCFU）合并放射治疗与单纯放射治疗进行前瞻性研究，对比观察其对骨转移癌疼痛的治疗效果，现将结果报道如下。     

红细胞生成素对放射治疗病人的保护与增敏作用

放射治疗是肿瘤治疗的主要方法之一,而其疗效则与放疗时肿瘤组织氧合度密切相关,因此,贫血与放射治疗疗效之间的关系一直是肿瘤放射治疗学者关注的焦点之一［１,２］。红细胞生长因子—红细胞生成素（ＥＰＯ）及重组人红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）可以调控血红蛋白（Ｈｂ）水平,并于近几年相继应用于临床,而且已经证明其可以改善放疗病人的生活质量,提高放疗疗效。本文就ＥＰＯ／ｒＨｕＥＰＯ对放疗病人的保护和增敏作用及其他相关的方面予以综述。一、肿瘤病人贫血的机理贫血是肿瘤病人常见的症状,而导致肿瘤病人贫血的原因则是…     

青蒿琥酯对人宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用

目的 探讨青蒿琥酯对人宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用。方法 应用⁶⁰Co γ射线照射细胞,吸收剂量率为0.635 Gy/min,照射剂量为0、1、2、4和6 Gy。采用MTT法检测青蒿琥酯对HeLa细胞的抑制作用,确定青蒿琥酯的最适实验作用浓度。克隆形成法检测青蒿琥酯对HeLa细胞放射敏感性的影响;采用"多靶单击数学模型"拟合HeLa细胞的剂量-存活曲线,得出平均致死剂量、准阈剂量及放射增敏比,评价其增敏效果。用流式细胞术检测HeLa细胞凋亡率,进一步检测青蒿琥酯对HeLa细胞的放射增敏性。结果 青蒿琥酯对HeLa细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增加,单纯照射1、2、4和6 Gy细胞的克隆形成率分别为91.67%、82.02%、58.60%和25.01%,加入青蒿琥酯后,相同照射剂量下克隆形成率分别降低为74.93%、60.53%、22.38%和5.05%;单纯照射组与药物+照射组的平均致死剂量(D₀)分别为2.95和2.07 Gy,准阈剂量(D_q)分别为2.01和1.24 Gy,放射增敏比(SER)为1.43。单纯2和6 Gy照射组细胞凋亡率分别是12.26%和40.08%,加入青蒿琥酯后,相同照射剂量下细胞凋亡率分别上升至22.71%和59.92%。结论 青蒿琥酯对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用成药物浓度依赖性;青蒿琥酯对HeLa细胞具有一定的放射增敏作用。     

Smac基因过表达对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的影响

目的探讨转染Smac基因过表达对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响,寻求改善宫颈癌放疗疗效的新途径。方法将Smac基因转染入宫颈癌HeLa细胞株,G418筛选获得亚克隆细胞,RTPCR、Westernblot法检测癌细胞Smac基因表达。X射线照射后,采用MTT比色法检测癌细胞体外生长活性;透射电镜、AnnexinV-FITC和碘化丙啶双染色流式细胞仪法检测癌细胞凋亡及比率;Westernblot、比色法检测细胞内Caspase-3蛋白表达和活性水平。结果RTPCR和Westernblot证实所获宫颈癌亚克隆细胞HeLaSmac的SmacmRNA、蛋白表达水平均显著高于HeLa(P<0.01)。8GyX射线照射后,HeLaSmac细胞生长活性较HeLa细胞减弱10.19%(P<0.01),透射电镜下可见部分HeLaSmac细胞发生典型凋亡形态学改变,凋亡率为16.4%,显著高于对照组HeLa细胞(凋亡率为6.2%,P<0.01)。与HeLa细胞比较,HeLaSmac细胞内Caspase3表达显著增加(P<0.01),活性水平提高3.42倍(P<0.01)。结论稳定转染外源性Smac基因使其在宫颈癌细胞株中过表达,能提高癌细胞中Caspase3的表达和活性,增强放疗对癌细胞的诱导凋亡作用,有望成为改善宫颈癌放疗效果的新途径。     

基因治疗联合放射治疗恶性肿瘤

肿瘤治疗是目前医学研究的重点之一,基因治疗与放射治疗方法的结合倍受重视,根据技术特点这种联合治疗方法主要有:免疫基因治疗联合放疗、直接杀伤或抑制肿瘤细胞的基因治疗联合放疗、抗肿瘤血管生成的基因治疗联合放疗以及辐射保护性基因治疗.综述了近年来基因治疗联合放射治疗恶性肿瘤的研究现状以及可能的作用机制.     

12C6+重离子诱导可溶性TRAIL表达增强及其抗肿瘤作用的实验研究

目的构建可被辐射诱导激活的表达载体pEgr-sTRAIL,研究其体外瞬时转染联合不同剂量的^12C^6＋离子辐照对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖活性的影响。方法SOEing PCR法克隆可溶性TRAIL基因,测序正确后连入pcDNA3.1-Egr质粒,构建pEgr-sTRAIL表达载体;采用GeneCompanionTM聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞;接受不同剂量的^12C^6＋照射后,RT-PCR法检测目的基因 mRNA水平的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞增殖存活。结果成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-sTRAIL;瞬时转染联合^12C^6＋离子照射可在mRNA水平上诱导sTRAIL表达增强;随照射剂量的增加,转染pEgr-sTRAIL的HeLa细胞凋亡率明显增加,克隆形成率明显下降。结论^12C^6＋离子可诱导重组质粒pEgr-sTRAIL在被转染的HeLa细胞中表达增高,体外基因-^12C^6＋离子联合治疗可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

东北红豆杉中19种单体化合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的 考察东北红豆杉中19种紫杉烷类(taxnae)化合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定东北红豆杉中19种紫杉烷类化合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.结果 处理HeLa细胞48h后,化合物5、7、16在10-4mol/L浓度对HeLa细胞的增殖有明显的抑制作用(P＜0.01),存活率依次为26.93%、20.79%和32.82%;在10-6～10-4mol/L浓度范围内,化合物3、14呈现一定的剂量依赖关系.结论 5种紫杉烷类化合物对宫颈癌HeLa细胞增殖有不同程度的抑制作用.     

新型稀土纳米双模态显像剂合成及其对胰腺癌放疗增敏体外实验研究

目的探讨NaHoF₄@CeO₂纳米颗粒(nanoparticles,NPs)CT、MRI双模态显像的可行性及其对胰腺癌细胞(Panc-1)的体外放疗增敏效果。方法合成并表征NaHoF₄@CeO₂纳米颗粒,并测定其粒径大小及主要元素物质含量。分别用MTT及动物实验测定NPs在体内外的毒性作用,CT及MRI成像仪评估NPs体外CT及MRI成像效果,MTT及细胞克隆实验验证单纯NPs组,单纯放疗(radiation therapy,RI)组及RI+NPs组对Panc-1放疗增敏效果。结果成功制备出粒径大小均匀、化学成分稳定的纳米复合材料NaHoF₄@CeO₂。NPs在体外无明显的细胞毒性作用,体外实验表明NPs具有良好的CT及MRI双模态成像作用。此外,体外放疗MTT实验及细胞克隆实验表明该材料对胰腺癌细胞有放疗增敏效果。结论NaHoF₄@CeO₂ NPs可同时进行CT、MRI双模态显像,通过体外细胞学实验表明,该纳米粒子具有对Panc-1细胞放疗增敏效果。     

Farnesyltransferase inhibitors as radiation sensitizers

PURPOSE: The inhibition of activated Ras combined with radiotherapy was identified as a potential method for radiosensitization. MATERIALS AND METHODS: Immunoblotting was used to control for prenylation inhibition of the respective Ras isoforms and for changes in activity of downstream proteins. Clonogenic assays with human and rodent tumour cell lines and transfected cell lines served for the testing of radiosensitivity. Xenograft tumours were treated with farnesyl transferase inhibitors and radiation and assayed for ex vivo plating efficiency, regrowth of tumours and EF5 staining for detection of hypoxia. Concurrent treatment with L-778,123 and radiotherapy was performed in non-small cell lung cancer (NSCLC) and head and neck cancer (HNC) patients. RESULTS: Blocking the prenylation of Ras proteins in cell lines with Ras activated by mutations or receptor signalling resulted in radiation sensitization in in vitro and in vivo. The PI3 kinase downstream pathway was identified as a contributor to Ras-mediated radiation resistance. Additionally, increased oxygenation of xenograft tumours was observed after FTI treatment. Combined treatment in a phase I study was safe and effective in NSCLC and HNC. CONCLUSIONS: Tumour cells with activated Ras were sensitized to radiation. Unravelling the underlying mechanisms promises to lead to even more specific drugs with higher potency and safety.     

乏氧靶向性自杀基因治疗系统增强胰腺癌放疗效果的实验研究

目的 探讨乏氧靶向性自杀基因治疗系统对胰腺癌放射治疗的增强效应。方法 借助DNA重组技术构建乏氧依赖性表达的重组腺病毒载体Ad-5HRE/hCMVmp-BCD。用Westernblot检测细菌胞苷脱氨酶(BCD)的表达,细胞生长抑制实验检测人胰腺癌MIA-PACA2细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性,裸鼠移植瘤实验观察Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC单独或联合放射治疗对MIA-PACA2细胞移植瘤的杀伤效应。结果 MIA-PACA2细胞感染Ad-5HRE/hCMVmp-BCD后,乏氧处理可诱导BCD蛋白的表达,并显著提高细胞对5-FC的敏感性。裸鼠移植瘤实验结果显示,Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC与放射治疗均可抑制胰腺癌移植瘤的生长,但两者联合可显著增强对移植瘤的抑制效应。结论 乏氧靶向性的Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC自杀基因系统可显著增强胰腺癌细胞的放疗效果,具有良好的临床应用前景。     

小剂量顺铂增敏CCRT治疗Ⅱb-Ⅳ期宫颈癌临床观察

目的探讨小剂量顺铂CCRT与单纯放射治疗中晚期宫颈癌的疗效和毒副作用。方法 2006~2009年收治的67例经病理确诊的Ⅱb-Ⅳ期宫颈癌患者,随机分为同步放化疗组35例和单纯放疗组32例,同步放化疗组给予顺铂400 mg/（次.w）行放疗增敏,两组同样放疗剂量。比较两组的治疗效果和不良反应。结果 CCRT组完全缓解率77.1%,单纯放疗组43.8%;总有效率：CCRT组94.3%,单纯放疗组71.9%;3年生存率：CCRT组88.6%,单纯放疗组68.8%,两组差异有统计学意义（P〈0.05）。结论小剂量顺铂增敏CCRT治疗晚期宫颈癌可显著提高有效率和生存率,急性不良反应与单纯放疗组相比无明显增加。     

Tumor-specific in vivo transfection with HSV-1 thymidine kinase gene using a Sindbis viral vector as a basis for prodrug ganciclovir activation and PET.

One type of gene therapy of tumors, gene-directed enzyme-prodrug therapy (GDEPT), holds considerable promise, although practical considerations limit its clinical applicability. These include the lack of acceptable noninvasive methods that are adaptable to humans for selective tumor targeting of the therapeutic genetic material. Sindbis virus is an oncolytic, alpha-virus that selectively targets tumors through the 67-kDa laminin receptor (LAMR). In this report we describe a novel approach that permits tumor-selective tumor targeting and quantitative in vivo monitoring using PET of a commonly applied GDEPT, based on herpes simplex virus thymidine kinase type 1 (HSVtk) and ganciclovir (GCV). METHODS: Sindbis/tk vectors were harvested from the supernatant of in vitro cultures of a packaging cell produced by electroporation of both replicon RNA (SinRep5/tk) and helper RNA (DH-BB) into baby hamster kidney (BHK) cells. The therapeutic effect of GCV was determined by incubation of transfected tumor cells with increasing concentrations of GCV. BHK tumors growing as xenografts in severe combined immunodeficiency disease (SCID) mice were transfected by parenteral administration of the vector. Imaging was performed using small-animal PET at 2 h after injection of 18F fluoro-ethyl-arabinosyluridine (18F-FEAU) and 24 h after the final parenteral injection of Sindbis/tk viral vector. RESULTS: The vector efficiently expresses the HSVtk enzyme in infected tumor cells, both in vitro and in vivo. High levels of HSVtk expression ensure sufficient prodrug GCV conversion and activation for bystander effects that kill the surrounding untransduced tumor cells. Tumor localization of intravenously administered 18F-FEAU after 2 and 3 parenteral vector treatments of Sindbis/tk demonstrated uptake of 1.7 and 3.1 %ID/g (percentage injected dose per gram), respectively. CONCLUSION: The vector efficiently targets the HSVtk enzyme gene into Sindbis-infected tumor cells. High levels of HSVtk expression ensure sufficient prodrug GCV conversion and activation for bystander effects that killed many surrounding untransduced tumor cells. In addition, the HSVtk activities in tumors can be noninvasively monitored using PET after systemic Sindbis/tk treatments as a basis for determining the levels and tissue distribution of vector, noninvasively in living animals, and for optimizing in vivo transfection rates of tumor.