Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的研制

目的 以Vero细胞为基质,研制安全有效的乙型脑炎灭活疫苗.方法 将经Vero细胞适应的乙型脑炎病毒P3株接种Vero细胞,培养后收获病毒液.采用β-丙内酯灭活,通过超滤浓缩、硫酸鱼精蛋白沉淀、蔗糖密度梯度离心等方法纯化病毒,最终配制成预防乙型脑炎病毒感染的疫苗.通过临床试验考察疫苗的安全性及免疫原性.结果 该疫苗的主要考核指标,如病毒滴度、总蛋白含量、Vero细胞DNA残留量、效价等均符合国家标准.临床观察结果显示,接种本疫苗后局部及全身反应轻微;各年龄组乙型脑炎病毒中和抗体阳转率均>90%.结论 采用本法制备的疫苗安全有效.     

Vero细胞HCP试剂盒在冻干乙型脑炎灭活疫苗生产过程中的应用

目的 通过检测冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）生产过程各道工序中的细胞残余蛋白,达到控制疫苗中Vero细胞残余蛋白的目的.方法 采用Vero细胞宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）试剂盒,对2009-2012年共65批冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）在病毒液收获、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、纯化、脱糖和半成品配制阶段中的HCP含量进行检测.结果 2009-2012年,病毒液收获阶段Vero细胞HCP含量无明显差异.2010年工艺优化后,2010-2012年的HCP平均值与2009年相比,在浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、纯化、脱糖、半成品配制阶段分别降低了78.83％、83.42％、78.62％、86.88％、86.40％.结论 通过Vero细胞HCP试剂盒的动态监测,可以对生产过程中Vero细胞的残余蛋白含量实施控制.     

无明胶保护剂冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）稳定性研究

目的  观察不含明胶的不同保护剂配方冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）的稳定性。方法  在现行冻干乙型脑炎灭活疫苗制备工艺的基础上,以乳糖替代明胶,并适当增加人血白蛋白用量至5、10和20 g/L,制成A、B、C三个保护剂配方疫苗。对疫苗进行25 ℃加速试验、37 ℃热稳定性试验和2～8 ℃长期稳定性试验,检测疫苗的有效抗原含量和效力（T值）,并与现行疫苗（对照）进行比较。结果  三个保护剂配方疫苗于25 ℃放置24周后,A、B疫苗有效抗原含量仅分别降低2.2%和5.9%,效力稳定;而C疫苗有效抗原含量降低13.6%,效力降低5.0%。37 ℃放置8周后,A、B、C疫苗有效抗原含量分别降低11.2%、13.2%、15.2%,效力分别降低5.8%、9.0%、7.2%。2～8 ℃放置48个月后,A、B、C疫苗有效抗原含量分别降低17.2%、18.4%、21.9%,效力均符合《冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）注册标准》。在上述试验中,A、B疫苗均优于或等于对照疫苗;C疫苗与对照疫苗差异较大,但均符合相关标准。结论  含A配方保护剂的冻干乙型脑炎灭活疫苗稳定性高且白蛋白用量少,因此,建议首选A配方保护剂。     

乙型脑炎病毒及疫苗研究进展

乙型脑炎病毒是黄病毒科中致病性最强的病毒之一,目前对该病毒的分子生物学研究进展较快.现阶段国内外主要使用三种类型疫苗,即鼠脑纯化灭活疫苗、原代地鼠肾细胞灭活疫苗和原代地鼠肾细胞减毒活疫苗.灭活疫苗和减毒活疫苗各有利弊.基因工程疫苗(包括载体重组活疫苗、嵌合减毒活疫苗、病毒样颗粒、亚单位疫苗及DNA疫苗)成为乙型脑炎疫苗发展的方向.     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究

目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针.比较样品不同处理方式的检测差异.对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证.结果 Vero细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260nm与280nm波长处的吸光度比值为1.88.探针灵敏度达到0.01 pg/μl.采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg.特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交.灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于-70℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg.结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测.     

WHO关于乙型脑炎疫苗的意见书

乙型脑炎是亚洲最重要的病毒性脑炎,目前大规模使用的乙型脑炎疫苗有鼠脑纯化灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗和细胞培养减毒活疫苗3种类型.本文介绍了乙型脑炎病毒、疫苗的使用情况以及WHO关于疫苗及其使用方面的意见.     

无血清条件下Vero细胞流感病毒的大规模培养

目的 探索在无血清条件下Vero细胞和流感病毒在反应器中的培养条件.方法 采用5 L反应器,接种经无血清适应的不同代次Vero细胞,观察细胞生长情况.以不同感染复数接种流感病毒,观察病毒的生长情况.结果 细胞在反应器中生长繁殖成功,4 d左右达到平台期,增殖倍数为5～16.接种甲型流感病毒后72 h,病毒血凝滴度达到高峰(1/64～1/128).结论 在无血清条件下,细胞和流感病毒都能在反应器中成功培养.     

乙型脑炎减毒活疫苗单次病毒收获液冻融条件研究

 目的  摸索乙型脑炎减毒活疫苗单次病毒收获液最适冻融条件。方法  将单次病毒收获液于不同温度中冻存不同时间后,在不同条件下融解,用噬斑法检测收获液病毒滴度,通过数据分析找到最适冻融方法。调整冻存袋内冻存病毒液的体积,确定冻存量对冻融效果的影响。结果  -70 ℃条件下冻存6个月,27 ℃水浴中解冻,对不同冻存量冻融前后单次病毒收获液滴度变化进行统计分析F=0.182,P=0.907。结论  确定了乙型脑炎减毒活疫苗单次病毒收获液最适冻融条件。     

流行性乙型脑炎疫苗致过敏反应二例

2002年6月我部对2 000例外出军训人员进行流行性乙型脑炎疫苗注射,发生过敏反应2例,发生率为0.1%,现报告如下.     

不同培养基和胰蛋白酶对Vero细胞培养及消化效果的比较

目的 比较不同公司生产的无血清培养基对病毒性疫苗生产用Vero细胞培养效果,及基因工程胰蛋白酶的细胞消化效果,以判断是否适用。方法 实验组用VirusPro Vero-A培养基进行Vero细胞的培养,用Trpzyme消化细胞。对照组用VP-SFM培养基进行细胞培养,用TrypLE Select消化细胞。两组Vero细胞以相同密度接种在T175培养瓶中,以相同的培养条件和传代方法在T175瓶和细胞工厂中各培养3代。培养期间观察细胞的上清液、形态以及汇合度,消化后检测细胞活率并计算细胞收获量。采用配对t检验比较两组消化液的pH值、总消化时长、37 ℃消化孵育时长、细胞活率以及细胞收获量。结果 两组细胞生长状态均良好。配对t检验显示,实验组消化液的pH值（6.99）、总消化时长（17.28 min）和37 ℃消化孵育时长（6.93 min）均值均大于对照组消化液的（分别为6.75、12.34 min、3.30 min）,细胞活率（94.79%）及细胞收获量（T175瓶：3.91×10⁷个;细胞工厂：1.90×10⁹个）均值均高于对照组的（分别为90.20%、3.33×10⁷个、1.26×10⁹个）,且差异有统计学意义（t值分别为9.17、3.46、2.98、2.31和4.38,P值均<0.05）。结论 实验组无血清培养基培养效果较好,基因工程胰蛋白酶细胞消化液温和、细胞损伤小,均适用于Vero细胞。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒群体的异质性分析

 目的  通过观察疫苗病毒群体中病毒个体的遗传和生物学特征,分析SA14-14-2株乙型脑炎减毒活疫苗病毒的均一性,为疫苗病毒的遗传稳定性提供实验证据。 方法   对3批疫苗病毒连续进行3次蚀斑纯化后,各挑选8个蚀斑纯化株,扩大培养一代。比较24个病毒纯化株的包膜（envelope,E）蛋白基因序列、单斑培养病毒滴度以及蚀斑特征。 结果   24个纯化株中共有6个病毒株（25%）的E蛋白核苷酸发生变化,其中2株（8.3%）的核苷酸变异导致其编码氨基酸发生改变,这些变异占总核苷酸变异数的28.6%。动物实验表明,这2个纯化株没有引起小鼠神经毒力变化。在所有24个纯化株中,我国2010年版药典规定的影响疫苗病毒遗传稳定性的8个E蛋白关键位点的氨基酸均未发生改变。24个纯化株病毒的蚀斑大小和形态以及单斑培养滴度均无明显差异。 结论   疫苗病毒具有典型的准种群体多样性特征,但在群体病毒中未检测到E蛋白氨基酸位点为野生型病毒位点的个体病毒,因此,疫苗病毒具有很好的减毒群体特征和遗传稳定性。     

乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达

目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。     

乙型脑炎病毒E315回复突变对小鼠神经毒力的影响

目的  构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 囊膜蛋白第315位氨基酸（E315）回复突变株,并分析该位点回复突变后在小鼠体内的神经毒力变化。方法  采用重叠PCR扩增含基因组第1921核苷酸位点回复突变的基因片段,替换SA14-14-2全长克隆的相应区域,获得回复突变株M315。通过测定突变株的蚀斑大小和一步生长曲线并与SA14-14-2进行比较,分析M315的增殖特征;采用小鼠模型测定该突变株的脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力和乳鼠传代返祖,分析疫苗株E315位点回复突变后毒力的变化。结果  成功构建了回复突变株M315,其蚀斑大小和增殖特征与疫苗株相似。M315对17~19日龄小鼠无皮下或腹腔入脑神经毒力,鼠脑病毒有很低但可检测的脑内神经毒力（小于3.0 lg蚀斑形成单位（plaque forming unit,PFU） / 0.03 ml）,皮下注射不发病。3~5日龄乳鼠脑内接种后发病,但脑内病毒毒力低于3.0 lgPFU / 0.03 ml。结论  在分子水平上证明了E315位点是影响乙型脑炎疫苗安全性的关键位点之一,但影响较弱。E315位点的回复突变虽使SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力和乳鼠传代返祖能力增强,但没有超出中国药典规定的毒力范围。     

乙型脑炎减毒活疫苗主种子批猴体神经毒力试验

 目的   为了解乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗主种子批弱毒株的神经毒力减弱程度,对其进行猴体神经毒力试验,以观察其安全性。 方法  对恒河猴脑内和脊髓内同时注射乙脑病毒强毒株SA14或减毒活疫苗主种子批弱毒株SA14-14-2,然后进行为期21 d的临床体征观察,并进行组织病理学检查。 结果   强毒株组动物接种后的临床体征为典型的神经毒性反应,动物发病并死亡。组织病理学检查显示,中枢神经系统严重受损,并有神经细胞坏死。弱毒株组动物仅出现短时发热,组织病理学检查可见轻微炎症反应,未见神经细胞坏死现象。 结论   乙脑减毒活疫苗主种子批的神经毒力高度减弱, 对恒河猴是安全的。