日本血吸虫大陆株脂肪酸结合蛋白SjFABPc编码区基因的体外扩增及克隆

目的体外扩增日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）抗原的编码区基因序列,将其克隆到真核表达质位pcDNA3中,为进一步对其进行核酸疫苗研究奠定基础。方法特定寡核苷酸引物的设计与合成;异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离日本血吸虫成虫RNA,RT－PCR扩增目的基因;分子克隆常规操作将扩增产物亚克隆至中间载体pUC18中,然后走向克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果RT－PCR特异性扩增出SjFABPc编码区基因序列,其片段大小为440hp;经酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pUC－SjFABPc和pCD－SjFABPc中含有所扩增的基因序列。结论RT－PCR扩增的SjFABPc抗原编码区基因序列与预期长度相村合;成功地构建了含目的基因的真核表达质粒pCD－SjFABPc。从而,为进一步对其进行DNA免疫系列研究工作奠定了基础。     

日本血吸虫大陆株脂肪酸结合蛋白SjFABPc编码区基因的体？…

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株脂肪膜结石（ＳｊＦＡＢＰｃ）抗原的编码区基因序列,将其克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,为进一步对其进行核到疫苗研究奠定基础。方法 特定寡核革酸引物的设计与合成;异硫氰酸胍－盼－氯仿一步法分离日本血吸虫成虫ＲＮＡ,ＲＴ－ＰＣＲ扩增目的基因,分子克隆常规操作将扩增产物亚克隆至中间载体ｐＵＣ１８中,然后定向克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,结果 ＲＴ－ＰＣＲ特异性扩增     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因在大肠杆菌的表达

目的　克隆并表达日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因以制备血吸虫疫苗候选分子。方法　利用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增日本血吸虫大陆株的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 基因, 经 Ｂａｍ Ｈ Ｉ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ双酶切后定向克隆于原核表达质粒 Ｐ Ｅ Ｇ Ｘ２ － Ｔ, 并在大肠杆菌进行表达研究。结果　获得目的基因克隆, 在大肠杆菌可诱导表达约４４ｋ Ｄ 的融合蛋白, 该重组抗原能被慢性血吸虫病人血清特异性识别。结论　成功地表达了一种血吸虫疫苗候选抗原, 为进一步研究打下基础。     

日本血吸虫大陆株卵黄铁蛋白基因重组及其真核表达

目的 构建日本血吸虫卵黄铁蛋白基因（SjYolFer)的真核表达重组质粒pLYolFer,转染Hela细胞进行表达,并对表达产物进行鉴定。方法 用PCR法从日本血吸虫大陆株成虫cDNA文库中扩增目的基因片段,经RNA班点杂交显示转录差异。然后定向克隆人表达载体pLXSN。转染重组体到Hela细胞中进行表达,并用SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果 PCR扩增产物大小约600bp左右,与雌虫RNA的杂交信号明显强于雄虫,获得重组质粒pLYolFer,特异性表达产物约为21ku,能被日本血吸虫感染兔血清及小鼠血清识别。结论 为进一步免疫原性实验奠定了基础。     

日本血吸虫普遍性结合酶E基因的获得和分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点.方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA,登录GenBank,利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析.结果获得了1个日本血吸虫新基因普遍性结合酶E基因(ubiqui-tin-conjugating enzyme E,AY251608),长854bp,编码149个氨基酸,与人类普遍性结合酶E具有55%的同源性,编码蛋白的理论分子量为7.149 8 kDa,等电点为8.01;抗原表位可能位于氨基酸序列373～396处.结论步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因.     

日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16的克隆与表达

目的　克隆和表达日本血吸虫新的分泌蛋白Sjsp16的编码基因。　 方法　根据EST测序的结果设计引物 ,从含有Sjsp16基因的cDNA克隆中扩增得到该编码基因 ,亚克隆入原核表达载体 pET2 8中表达 ,然后用生物信息学的方法对蛋白结构功能进行预测。　结果　成功克隆和表达了日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16,生物信息学分析提示该基因编码蛋白的N端带有一个信号肽序列 ,是一个分泌蛋白 ,含有一个ML功能结构域 ,具有 4种潜在的功能作用位点 ,即 1个N 糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 3个肉豆蔻酰化位点。　结论　Sjsp16基因编码蛋白为具有脂质识别和结合功能的分泌蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病药物靶点或疫苗候选分子。     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆和表达日本血吸虫BBC1（SjBBC1）基因，为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5．0引物设计软件自行设计引物，PCR扩增SjBBC1基因，将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后，亚克隆人pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp，与预期大小相符。将该基因克隆人原核表达载体pQE30，表达蛋白分子质量单位约为23．6ku，并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30／SjBBC1原核表达重组体载体，表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫中国大陆株安徽品系特异rDNA的制备及其基因克隆

目的为了制备能检测日本血吸虫种内多态性的ｒＤＮＡ探针,以用于不同地域日本血吸虫品系间差异的研究。方法根据曼氏血吸虫大、小亚基的基因序列,设计引物,ＰＣＲ扩增得到４．４ｋｂ的日本血吸虫中国大陆株安徽品系的ｒＤＮＡ片段,经纯化后克隆入ｐＵＣ１８质粒。结果得到了２个转化成功的含日本血吸虫中国大陆株ｒＤＮＡ基因的重组质粒的ＪＭ１０３菌落。结论我们采用的方法,使获取目的基因片段的手段更为简单、方便。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因克隆

目的 :克隆日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因。方法 :用 PCR方法根据已发表日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白基因部分核苷酸序列扩增大陆株副肌球蛋白基因。结果 :获得一日本血吸虫大陆株 72 0 bp基因克隆。结论 :经核苷酸序列分析证实 ,本克隆基因与菲律宾株基因核苷酸同源性为 99.0 3%。