结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌抗原Rv0173的克隆、表达与纯化

目的 在大肠杆菌中表达、纯化结核分枝杆菌Rv0173抗原,为研制新型结核病疫苗打下基础.方法 将结核杆菌抗原Rv0173的全长cDNA插入到原核表达载体pGES-4T-1中,构建成Rv0173重组质粒.将重组质粒转入大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白.结果 获得了pGEX4T-Rv0173 重组子,Rv0173蛋白在BL21菌中获得表达,表达的蛋白条带大小约45KD,与预期结果相符.结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Rv0173进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c表达与结核分枝杆菌耐药关系探讨

目的研究外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c的表达与结核分枝杆菌（MTB）不同耐药表型的关系。方法提取2017 — 2018年浙江省宁波市疾病预防控制中心耐药监测期间收集的102株MTB核糖核酸（RNA），应用实时荧光定量PCR方法检测ABC转运蛋白超家族外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c的表达量，采用Mann-Whitney U检验分析外排泵基因表达在不同耐药表型菌株中的差异。结果Rv1457c和Rv1458c基因表达量在利福平耐药组中的中位数及四分位数间距［0.507（0.378 ~ 1.444），1.842（1.325 ~ 2.628）］高于利福平敏感组［0.418（0.357 ~ 0.618），1.545 （1.189 ~ 2.065）］，差异有统计学意义（Z＝2.030、2.108，均P＜0.05）。 耐多药组Rv1457c和Rv1458c基因表达量的中位数及四分位数间距［0.538（0.419 ~ 1.490），1.941（1.471 ~ 2.659）］，高于非耐多药组［0.415 （0.337 ~ 0.618），1.533 （1.122 ~ 2.056）］，差异有统计学意义（Z＝2.865、2.896，均P＜0.05）。 异烟肼耐药组和敏感组中Rv1456c、Rv1457c的高表达率均存在差异（χ2＝4.858、6.789，均P＜0.05），利福平耐药组和敏感组中Rv1456c的高表达率差异有统计学意义（χ2＝8.424，P＜0.05），链霉素耐药组和敏感组中Rv1457c的高表达率差异有统计学意义（χ2＝4.545，P＜0.05），乙胺丁醇耐药组和敏感组中Rv1456c、Rv1457c的高表达率差异均有统计学意义（χ2＝5.142、10.202，均P＜0.05）。结论外排泵基因Rv1457c、Rv1458c的相对表达量增加与MTB对利福平耐药有关。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

结核分枝杆菌耐药基因与检测方法的研究进展

结核分枝杆菌(MTB)的高耐药问题已成为新世纪结核病控制的三大难题之一[1].近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,人们对MTB耐药的分子机制进行了深入研究,并已取得了很大进展.本文就此内容综述于下.     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

结核潜伏感染蛋白Rv1737cB细胞、CTL及Th表位预测与分析

目的利用生物信息学方法建立一套预测B细胞、CTL及Th细胞免疫功能多肽的方法,用于筛选新型结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。方法采用DNAStar软件包中的Protean软件从α螺旋、β折叠及转角等二级结构的数量和分布、亲水性和表面可及性等方面预测分析该蛋白序列成为B细胞表位的可能性,预测CTL表位时,先采用Blast方法分析该序列与人类序列的同源性,然后综合应用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及Net CTL预测其CTL表位,应用RANKPEP及SYFPEITHI超基序法远程预测Th细胞表位,筛选表位集中、分值较高者作为候选多肽片段。结果 Protean软件预测结果表明Rv1737c蛋白序列亲水性和表面可及性都较弱,α转角、β折叠结构数目较多且分布广泛,而转角及卷曲结构较少,B细胞表位数目较少;Rv1737c蛋白的CTL及Th表位主要集中于第100位氨基酸之后,其中与HLA-A2表型相对的CTL表位,与HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型相对的Th表位较其他表型数目较多、分值较高。结论 Rv1737c蛋白可能不利于作为B细胞抗原,但其可能是一种较好的T细胞抗原,成为结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。     

江西省3个监测点结核分枝杆菌耐药性及耐药基因检测分析

  目的  了解江西省国家级结核病耐药监测点确诊病例的分枝杆菌分离菌株耐药性及耐药基因突变情况,为耐药结核病防治策略制定提供科学依据。  方法  采用罗氏药敏方法测定结核分枝杆菌的耐药性,并采用PCR-线性杂交酶法进行表型耐药菌株耐药基因检测。  结果  2019年3个监测点共纳入病例280例。 获得264株分离菌株,250株为结核分枝杆菌,14株为非结核分枝杆菌。 大余县、进贤县和广丰区3个监测点的分离株总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率分别为25.60%（64/250）、7.20%（18/250）、3.20%（8/250）、5.60%（14/250）;男性分离株耐药检出率高于女性;S315T1是本地区异烟肼耐药基因突变的主要型别,gyrA基因突变是江西省结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的主要基因。  结论  使用PCR-线性杂交酶法筛查一线药、二线药耐药基因突变,对确定治疗方案及结核病的防控有重要意义。 江西省要加强对耐药结核病患者的管理,控制传染源,从而减少耐药菌株的产生和传播。     

结核分枝杆菌耐药基因与检测方法的研究进展

结核分枝杆菌(MTB)的高耐药问题已成为新世纪结核病控制的三大难题之一[1]。近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,人们对MTB耐药的分子机制进行了深入研究,并已取得了很大进展。本文就此内容综述于下。一、研究内容近年来,国内外研究者主要从遗传学领域研究入手,企图阐明MTB耐药的分子基础,以找出耐药基因序列。并寻找耐一种药物可能存在的多种耐药基因、寻找耐多药菌株的可能耐药机制、寻找耐药基因突变与可能的诱变因素之关系,建立快速检测MTB耐药基因型的分子生物学诊断技术,以便在控制结核病的流行中发挥作用。二、研究进展(一)阐…     

结核分枝杆菌Rv3737抑制巨噬细胞自噬促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活

目的 了解结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737对耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的作用。方法 通过PCR扩增结核分枝杆菌Rv3737目的基因,T4连接酶连接Rv3737及穿梭质粒pMV261,构建pMV261-Rv3737,双酶切及测序验证pMV261-Rv3737,通过电转将pMV261-Rv3737及pMV261-Vector电转至耻垢分枝杆菌感受态细胞中以构建过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌菌株（MS::pMV261-Rv3737）和对照菌株（MS::pMV261）,PCR及Western blot验证过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌菌株。利用分光光度计检测OD600评估过表达Rv3737对耻垢分枝杆菌体外生长的影响。将MS::pMV261-Rv3737及MS::pMV261感染巨噬细胞,通过菌落形成单位（CFU）计数检测耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,用Western blot及激光共聚焦检测自噬相关蛋白LC3II的变化。结果 Rv3737不影响耻垢分枝杆菌的体外生长,但促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,过表达Rv3737明显抑制LC3II的表达,激光共聚焦结果显示过表达Rv3737...     

耐药结核分枝杆菌检测方法的研究进展

传统的结核分枝杆菌耐药性的检测,是依靠培养法进行药敏试验,是体外结核分枝杆菌耐药性的直接证据,但费时、费力。近年来,已建立了一些新的耐药性检测方法。西方不耐药基因突变的检测及耐药表型的检测这两方面作一综述。     

结核分枝杆菌耐药机制及耐药性检测的研究进展

自 2 0世纪 80年代以来 ,结核病疫情重新上升 ,成为严重危害公共卫生的问题之一。据世界卫生组织估计 ,目前全球约有 2 0亿人感染结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,其中约有 5 0 0 0万人感染耐药结核菌[1] 。因此对结核菌耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。结核菌的耐药性的产生主要是由于不合理用药引起的结核菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[2 ] 。目前检测结核菌耐药性的方法有表型检测和基因型检测两大类。一、结核菌的耐药机制染色体基因变异是结核菌产生耐药性的主要机制。结核菌 95 %以上的基因变异是直接由于抗结核药物引起[2 ] 。细菌…     

结核分枝杆菌耐药性检测研究进展

自20世纪80年代以来，结核病疫情重新上升，据WHO估计，目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(TB)，其中约有5000万人感染耐药TB。因此对TB耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。分子生物学技术的发展，为研究TB提供了良好技术平台，极大地促进了TB耐药性检测的研究进程。目前临床正在使用和研究的药敏试验方法归纳起来有表型和基因检测2类。     

结核分枝杆菌Rv3407基因的克隆及重组质粒的构建

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球约有1／3的人口感染MTB,我国是世界上结核病负担最重的22个国家之一,近年来,由于卡介苗（BCG）保护性不完善、多重耐药MTB的出现、与人类免疫缺陷病毒（HIV）的协同感染以及人口流动等原因使TB疫情日益严重,我国新生儿感染率为美国的8倍。     

结核分枝杆菌培养及耐药监测

目的调查分析衢州市结核分枝杆菌的耐药情况,为预防及临床治疗提供科学依据。方法结核分枝杆菌培养使用Bact／Alert3 D120全自动培养仪,药敏试验采用WHO推荐的比例法。结果74株结核分枝杆菌的总耐药率为31．1％,原发耐药率为19．6％,获得性耐药率为50．0％,获得性耐多药率为7．1％。结论衢州市结核分枝杆菌原发耐药率、耐多药率及获得性耐药率高于全国平均水平,且本地区结核分枝杆菌耐药以耐链霉素、利福平及异烟肼为主。     

结核分枝杆菌H37Rv株菌体抗原及分泌抗原分析

目的 对比分析人型结核枝杆菌（结核菌）H37Rv株固体培养菌、液体培养菌及分泌蛋白中抗原成分的差异，寻找结核菌的主要免疫抗原。方法 应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、免疫印迹技术及单克隆抗体技术分析人型结核菌H37Rv株固体培养、液体培养及其分泌蛋白中的抗原成分。结果 固体培养菌与液体培养菌具有基本一致的多肽抗原成分，其主要成分分子量为79000、64000、54000、50000、28000～38000、23000等，而分泌蛋白差异稍大，其主要成分分子量为66000、63000～65000、55000、42000、32000～34000、24000、16000等。单克隆抗体进一步证明66000、55000、16000为分泌蛋白。多克隆抗体免疫印迹分析表明，菌体主要免疫原有79000、54000、38000～50000、28000蛋白成分，而分泌蛋白主要免疫原为分子量66000、55000～64000、30000～34000、24000、16000成分。结论 人型结核菌H37Rv株菌体蛋白和分泌蛋白具有不同的主要免疫原，将有助于认识H37Rv株的总体蛋白组成及寻找与结核病相关的特异性抗原成分。     

耐药结核分枝杆菌检测方法的研究进展

传统的结核分枝杆菌耐药性的检测,是依靠培养法进行药敏试验,是体外结核分枝杆菌耐药性的直接证据,但费时、费力。近年来,已建立了一些新的耐药性检测方法。本文就耐药基因突变的检测及耐药表型的检测这两方面作一综述。