共表达野生型p53及siRNA-mdm2质粒的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建可同时表达野生型p53 (wt-p53)及siRNA-mdm2的重组真核表达载体用于激素非依赖性前列腺癌的联合基因治疗。方法：利用亚克隆、T-A克隆和PCR技术合成并构建pcDNA3.1-p53、siRNA-mdm2、p53/siRNA-mdm2和siRNA-scramble重组质粒。脂质体法将上述重组质粒转染至PC-3细胞,半定量RT-PCR和Western blotting检测共表达质粒对mdm2和p53表达的影响,MTT法检测共表达质粒转染后PC-3细胞增殖活性。结果：克隆出wt-p53全长及带有U6启动子的siRNA-mdm2序列,经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建上述真核重组表达载体;转染细胞48 h后可见siRNA-mdm2组GFP明显表达; RT-PCR和Western blotting检测显示转染共表达质粒后PC-3细胞中 wt-p53表达增强,mdm2表达下调;MTT检测显示共表达质粒转染后PC-3细胞生长抑制率为40.4%。结论：成功构建p53与siRNA-mdm2共表达质粒,共表达质粒可抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖。     

Rh_2诱导PC-3M细胞凋亡及对新基因GRIM-19表达的影响

目的:研究人参单体皂甙Rh2对PC-3M细胞株(激素非依赖性人前列腺癌细胞)的致凋亡作用及对新基因GRIM-19表达的影响。方法:采用吖啶橙染色观察其对PC-3M胞的促凋亡作用;RT-PCR和Westernblot方法分别检测用药后PC-3M细胞GRIM-19mRNA和蛋白的表达。结果:不同剂量的Rh2作用于PC-3M细胞24h吖啶橙染色结果呈阳性;RT-PCR结果与Westernblot结果相一致,Rh2随浓度的增加GRIM-19mRNA和蛋白表达逐渐增强,Rh2中低剂量组与对照组比较差异显著(P<0.05),Rh2高剂量组GRIM-19表达与对照组比较差异十分显著(P<0.01)。结论:Rh2诱导PC-3M细胞凋亡与上调GRIM-19基因和蛋白表达有关,其表达强度呈剂量依赖性。     

TIMP-3对前列腺癌PC-3M细胞株增殖和侵袭能力的影响

目的：观察TIMP-3对前列腺癌细胞PC-3M增殖和侵袭能力的影响。 方法：实验分为前列腺癌细胞PC-3M组、转染空质粒PCDNA3.1的PCDNA-PC-3M组和转染 TIMP-3的PCDNA-TIMP-3-PC-3M组。采用黏附实验、MTT比色法对比观察稳定转染的PCDN A-TIMP-3-PC-3M与PCDNA-PC-3M的黏附能力和增殖活力。采用单层细胞侵袭和Boyden 小室侵袭实验,对比观察TIMP-3对PC-3M细胞体外侵袭能力的影响。 结果：稳定转染TIMP-3的PC-3M细胞的黏附率和细胞增殖速度明显低于空质粒组和未 转染 组(P<0.05),稳定转染TIMP-3的PC-3M细胞的侵袭指数明显低于空质粒组和未转染 组（P<0.05）,空质粒组和未转染组间细胞增殖速度和细胞侵袭指数比较差异无显著 性（P>0.05）。 结论：TIMP-3对前列腺癌PC-3M细胞增殖和侵袭能力具有抑制作用。     

Stat3 mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达

目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3（Stat3mRNA）的微小RNA（MicroRNA）表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为：76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为：73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为：89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。     

人参皂苷Rh2诱导PC-3M细胞凋亡及其对新基因GRIM-19表达的影响

目的:研究人参单体皂苷Rh₂对激素非依赖性人前列腺癌细胞(PC-3M细胞株)的致凋亡作用及其对新基因GRIM-19表达的影响。方法:实验分为Rh₂高剂量组（40 mg·L^-1）、Rh₂中剂量组（30 mg·L^-1）、Rh₂低剂量组（15 mg·L^-1）及对照组（未加药组）。分别作用于PC-3M细胞24 h,吖啶橙染色观察其对PC-3M细胞的促凋亡作用;RT-PCR和Western blotting方法分别检测Rh₂对PC-3M细胞GRIM-19 mRNA及其蛋白表达的影响。结果:Rh₂高、中、低剂量组作用于PC-3M细胞24h吖啶橙染色均呈阳性结果。Rh₂低剂量组出现典型“出芽”现象,细胞中出现致密鲜亮橙色斑点。对照组细胞呈均匀绿色;RT-PCR结果显示,GRIM-19 mRNA随Rh₂浓度的增加表达逐渐增强,Rh₂中、低剂量组与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）,Rh₂高剂量组GRIM-19 mRNA表达与对照组比较差异具有高度显著性（P<0.01）。Western blotting结果与RT-PCR结果相一致,GRIM-19蛋白随Rh₂浓度的增加其表达逐渐增强,Rh₂中低剂量组与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）,Rh₂高剂量组GRIM-19蛋白的表达与对照组比较差异具有高度显著性（P<0.01）。结论:Rh₂诱导PC-3M细胞凋亡与上调GRIM-19基因和蛋白表达有关,其表达强度呈剂量依赖性。     

CD147 RNA干扰对前列腺癌细胞生长的影响

目的观察针对CD147RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞生长的影响。方法用针对CD147分子的3个RNA干扰片段构建的表达载体转染PC-3细胞,获得稳定表达株。通过RT-PCR检测转染后CD147分子mRNA的表达水平变化;MTT法检测各组PC-3细胞增殖变化。结果RT-PCR结果发现第1、3干扰片段可以较好的封闭前列腺癌PC-3细胞CD147分子mRNA表达水平;MTT法显示CD147分子封闭后对前列腺癌PC-3细胞的生长无影响(P>0.05)。结论封闭CD147分子对前列腺癌PC-3细胞的生长无影响。     

SIRT6对前列腺癌细胞株增殖能力和凋亡水平的影响

目的:探讨SIRT6对前列腺癌细胞增殖能力和凋亡水平的影响。方法:采用Western印迹法观察比较SIRT6在3种前列腺癌细胞(LNCAP、PC-3、DU145)和前列腺上皮细胞(RWPE-1)中的表达水平;将PC-3细胞分为两组:SIRT6转染组(SIRT6-过表达质粒转染)和对照组(空质粒转染),用CCK-8法、Annexin V和PI双染法分别观察过表达SIRT6后对前列腺癌细胞增殖能力和凋亡水平的影响。结果:与前列腺上皮细胞比较,3种前列腺癌细胞中SIRT6的表达显著降低(P0.01);SIRT6转染后,PC-3细胞中SIRT6表达增高(P0.01),PC-3细胞增殖能力下降(P0.05),凋亡水平升高(P0.01)。结论:SIRT6可能对前列腺癌细胞的增殖能力有抑制作用,对前列腺癌细胞的凋亡有促进作用。     

hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

目的研究抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。方法构建表达载体：空质粒pEGFP—N1、pEGFP—N1-PTEN质粒、pEGFP—N1-p53质粒及pEGFP—N1-PTEN—p53质粒,体外分别转染到前列腺癌Pc-3m细胞中,观察它们转染后的荧光表达情况;采用RT—PCR法检测目的基因表达;Westernblotting法检测目的PTEN蛋白和P53蛋白的表达;用MTT法观察细胞增殖抑制情况并绘制生长抑制曲线;AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术检测PTEN基因和p53基因对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。结果荧光显微镜下观察到PTEN、p53及两个基因同时在PC-3m细胞系中成功表达;RT—PCR检测结果显示,与PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组相比联合转染组mRNA在PC-3m细胞系中表达明显增加俨〈0．05）;Westernblotting法检测同样发现,联合转染组PTEN蛋白及P53蛋白表达明显高于PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组俨〈0．05）;联合转染组细胞凋亡率明显高于空载体转染组、PTEN基因单转染组和p53基因单转染组（P〈0．05）。结论PTEN基因与p53基因联合转染能诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡．这种联合转染可能对前列腺癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

携带siRNA-Stat3质粒减毒沙门氏菌对肝原位移植瘤的治疗作用

目的：观察携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝脏原位移植瘤的治疗作用及效果。方法：将siRNA-Stat3质粒经电转化方法转入减毒鼠沙门氏菌中,将肝原位移植瘤小鼠分为mock未治疗组、pGC-Si-Stat3组和pGC-Si-Scramble组。pGC-Si-Stat3组小鼠灌胃转化有siRNA-Stat3质粒减毒沙门氏菌,pGC-Si-Scramble组小鼠灌胃转化有空质粒的减毒沙门氏菌,未治疗组小鼠灌胃PBS,观察pGC-Si-Stat3组Stat3 mRNA和蛋白表达水平。结果：与未治疗组和pGC-Si-Scramble组比较,携带有siRNA-Stat3质粒治疗组肝原位移植瘤体积明显缩小(P<0.05),瘤重减轻(P<0.05)。与其对应的 mRNA和蛋白表达泳道光密度值较未治疗组和pGC-Si-Scramble组明显降低（P<0.01﹚。结论：携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝原位移植瘤的生长具有显著抑制作用。     

GRIM-19在子宫腺肌病中的表达及促进疾病发展的机制研究

目的 研究诱导细胞凋亡相关基因-19(GRIM-19)在子宫腺肌病患者子宫内膜组织中的表达水平,并探讨其在疾病发生发展中的分子机制.方法 取30例子宫腺肌病患者异位和在位内膜组织,采用免疫组织化学和Western blot检测内膜组织中GRIM-19、磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(pSTAT3)和内皮生长因子(VEGF)的表达水平.采用TUNEL检测内膜组织凋亡,CD34抗体直接检测内膜组织新生血管形成.构建GRIM-19 siRNA和重组质粒,转染Ishikawa细胞后检测下游信号分子pSTAT3、信号转导和转录激活因子3(STAT3)和VEGF的变化.结果 与对照组相比,子宫腺肌病患者在位内膜和异位内膜组织中GRIM-19表达水平降低.在位内膜和异位内膜组织中细胞凋亡减少,微血管密度、pSTAT3和VEGF表达水平升高.转染Ishikawa细胞,下调GRIM-19表达可显著激活pSTAT3和VEGF.结论 GRIM-19通过抑制细胞凋亡和增加新生血管形成,促进子宫腺肌病的发生发展.     

GRIM-19及其靶基因产物STAT3与肺癌相关性的研究

目的观察干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关的基因(GRIM-19)蛋白及其靶基因产物转录信号转导子与激活子3(STAT3)蛋白在肺癌组织和癌旁组织中的表达,探讨GRIM-19及其靶基因产物STAT3在肺癌发生、发展中的作用。方法用Western blot方法检测37例人肺癌及其癌旁组织中GRIM-19蛋白、STAT3蛋白水平的表达,对两组蛋白的表达与相关临床病理特征进行统计学分析。结果①在肺癌组织中GRIM-19蛋白表达明显低于癌旁组织(P<0.01),而STAT3蛋白表达则高于癌旁组织(P<0.01),且GRIM-19与STAT3在肺癌组织中的表达呈负相关(r=-0.327;P<0.05)。②GRIM-19蛋白表达水平与肺癌临床分期相关(P<0.05),而STAT3蛋白表达水平则与肺癌临床分期(P<0.05)及是否有淋巴结转移相关(P<0.05),两者均与患者性别、年龄、组织分型、吸烟指数之间无关联(P>0.05)。结论GRIM-19和STAT3蛋白在肺癌组织中有表达,并与临床分期相关,提示GRIM-19作为一个新的细胞凋亡促进基因,在肺癌的发生发展过程中可能发挥着重要的作用。     

PKCzeta在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞增殖的影响

目的 检测PKCzeta在不同分级前列腺癌(PCa)组织的表达情况,并探究PKCzeta的表达对前列腺癌细胞系增殖的影响.方法 采用免疫组织化学染色法检测19例前列腺癌组织和4例正常前列腺组织的PKC-zeta表达情况,并按肿瘤分级分为3组,进行PKCzeta表达的差异性分析;应用Hilymax试剂转染PKCzeta质粒(CA-PKCzeta)过表达前列腺癌细胞PKCzeta;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot分别检测PC3和DU145细胞内PKCzeta的mRNA和蛋白水平;利用平板克隆形成试验和CCK-8试剂盒检测PC3和DU145细胞增殖能力的差异以及转染PKCzeta质粒后细胞增殖的变化.结果 PKCzeta在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P＜0.05),而且低分级(1级)前列腺癌PKCzeta的表达高于高分级(2～3级)前列腺癌(P＜0.05).DU145细胞的PKCzeta表达高于PC3细胞,而其增殖速度较PC3细胞低;过表达PKCzeta使前列腺癌细胞系的增殖受抑.结论PKCzeta与肿瘤分级存在负相关关系,在癌症早期可能有一定的保护作用,且过表达PKCzeta能抑制前列腺癌细胞的增殖.     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

GRIM-19及其靶基因产物STAT3在十二指肠癌中的表达及其意义

目的:研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19(GRIM-19)及其靶基因产物信号转导和转录活化因子3 (STAT3)在十二指肠癌中的表达,探讨其在十二指肠癌发生和发展中的作用.方法:32例十二指肠癌组织和30例十二指肠炎及溃疡对照组织,采用免疫组织化学方法检测其GRIM-19及STAT3蛋白表达情况.结果...     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。