大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长与可溶性混合晶状体蛋白的促进作用：体外培养实验

目的：观察不同培养基中血清和混合晶状体蛋白对视网膜神经节细胞的影响，探讨晶状体损伤后其促进视网膜神经节细胞存活和再生的作用。方法：实验于2004-04／07在解放军第三军医大学西南眼科医院眼科实验室完成。选择成年Long Evens大鼠8只用于可溶性混合晶状体蛋白的提取；选择新生0～2d Long Evens大鼠30只用于视网膜神经节细胞的培养。分别用下列3组培养基对离体视网膜神经节细胞进行培养：①100mL／L新生牛血清+900mL／L DMEM／F12培养基(新生牛血清+DMEM／F12组)。②100mL／L新生牛血清+100mL／L胎牛血清+800mL／L DMEM／F12培养基(新生牛血清+胎牛血清+DMEM／F12组)。③100mL／L胎牛血清+900mL／L DMEM／F12培养基(胎牛血清+DMEM／F12组)。每组又分为6个亚组，其中5个亚组分别加入5种不同终浓度的可溶性混合晶状体蛋白(1，0．5，0．02，0．01，0．005mg／L)溶液，一个亚组不加可溶性混合晶状体蛋白液。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，记录存活细胞数和存活时间。培养2，4，6d后，计数每视野分散的、有突起生长的视网膜神经节细胞数和最长突起长度(每一视野随机取5个细胞进行测量，共30个视野，150个突起)应用Leica QWin图像分析系统。结果：①视网膜神经节细胞存活时间：新生牛血清+DMEM／F12组培养细胞能存活六七天，新生牛血清+胎牛血清+DMEM／F12组和胎牛血清+DMEM／F12组培养细胞能存活七八天。②有突起生长的视网膜神经节细胞数目和最长突起长度：在相同培养天数(2，4，6d)和条件下(加入同一终浓度晶状体蛋白)新生牛血清+胎牛血清+DMEM／F12组细胞数目均多于新生牛血清+DMEM／F12组[加入0．5mg／L晶状体蛋白，2d时(3．83&;#177;4．53比0．14&;#177;0．38)个／视野，(4d时14．7&;#177;9．62比2．5&;#177;3．89)个／视野．P&;lt;0．01；6d时(20．13&;#177;12．32比5．43&;#177;5．62)个／视野，P&;lt;0．05]；在4d内胎牛血清+DMEM／F12组细胞突起长度明显优于新生牛血清+胎牛血清+DMEM／F12组(P&;lt;0．01)；加入混合晶状体蛋白后细胞存活时间及突起长度明显长于未加晶状体蛋白组，晶状体蛋白液含量为0．01mg／L时，作用较明显。结论：加入晶状体蛋白液和不同血清的培养基两因素间无交互作用，分别独立地发挥作用。可溶性混合晶状体蛋白可以促进体外培养的视网膜神经节细胞存活和突起生长。     

不同体积分数脐血血清与骨髓间充质干细胞的增殖

背景：制备脐血血清体外扩增、培养间充质干细胞成为目前的研究热点,但尚无不同体积分数脐血血清对骨髓间充质干细胞的增殖能力的影响的报道。目的：观察比较不同体积分数的脐血血清对骨髓间充质干细胞的增殖能力的影响。方法：无菌条件下取20例人骨髓标本,采用密度梯度离心法提取单个核细胞,分别用体积分数为5%,7.5%,10%,15%,20%的脐血血清＋DMEM/F12培养基,行骨髓间充质细胞培养,取第3代细胞,用MTT法观察不同体积分数的脐血血清对间充质干细胞的增殖能力的影响。结果与结论：在体积分数5%,7.5%,10%的脐血血清＋DMEM/F12培养基组,细胞增殖能力较佳,明显优于体积分数15%,20%的脐血血清＋DMEM/F12培养基组,差异有显著性意义（P〈0.05）。说明在较低体积分数脐血血清培养体系中,骨髓间充质干细胞增殖状态活跃。     

亚健康疲劳状态时血清对骨骼肌细胞线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和线粒体能量负荷的影响

背景：前期研究表明亚健康疲劳者血清对体外培养骨骼肌细胞的生存活力和细胞超微结构具有显著影响代谢方面观察亚健康疲劳时血清对骨骼肌细胞的影响。目的：以亚健康状态时血清培养人骨骼肌细胞，观察线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和能量负荷的变化培养结果相比较。设计、时间及地点：对比观察实验，于2006—10／2007叭在南方医科大学中医证候研究实验室完成。实验进一步从能量并与健康状态血清材料：25～40岁符合中医相关男性亚健康疲劳状态诊断标准者10名，治疗前后采血分别制备亚健康疲劳状态血清和正常状态血清，人骨骼肌细胞购于美国Sciencell研究实验室。方法：将人骨骼肌细胞常规培养、细胞融合达80％以上时，按随机数字表法分为4组，20％亚健康状态血清组、30％亚健康状态血清组、20％正常状态血清组、30％正常状态血清组。分别用含不同浓度亚健康状态血清和正常状态血清DMEM／F12细胞培养液培养。主要观察指标：培养24，48，72h时，采用生物化学法和高效液相色谱法测定人骨骼肌细胞线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含量。结果：含20％亚健康状态血清和含20％，30％正常状态血清DMEM／F12细胞培养液培养人骨骼肌细胞在72h内，细胞线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和能量负荷各时点差异均无显著性意义（P〉0．05），含30％亚健康状态血清DMEM／F12细胞培养液在培养人骨骼肌细胞48h和72h时，细胞线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和能量负荷显著降低，与其他各时点比较，差异有显著性意义（P〈0．05）。进一步分析显示，线粒体能量负荷与线粒体膜细胞色素C氧化酶活性呈正相关。结论：亚健康疲劳状态时血清可致人骨骼肌细胞呈现能量代谢障碍的表现。     

不同剂量神经节苷脂对神经干细胞增殖和分化的影响

背景：近年来研究表明神经节苷脂(gangliosides，GM-1)能够修复中枢神经系统中神经元的损伤。目的：观察不同剂量神经节苷脂(GM-1)对神经干细胞增殖和分化的影响。设计：完全随机对照的开放实验。地点与材料：研究地点为郑州市第二人民医院脑外科和郑州大学医学生物工程研究所。材料为胎龄10周流产胚胎脑组织。方法与主要观察指标：从人胚胎脑组织分离出神经干细胞，培养于含bFGF和B27的DMEM／F12细胞营养液中，实验组加入不同浓度的GM-1，用MTT比色分析法测定细胞增殖能力。用含3％血清的DMEM／F12营养液诱导细胞分化，每间隔6h于倒置相差显微镜下观察细胞分化情况。结果：5d，10dMTT比色显示：bFGF(20mg／L)+B27+DMEM／F12和GM-1(33．5mg／L)+B27+DMEM／F12两组间t检验，P值均&;gt;0．05；GM-1(33．5mg／L)+B27+DMEM／F12与B27+DMEM／F12两组间t检验，P值均&;lt;0．05；GM-1(0．335mg／L)+B27+DMEM／F12，GM-1(3．35mg／L)+B27+DMEM／F12与B27+DMEM／F12间t检验，P值均&;gt;0．05。分化实验发现，接种6h后，(3％)血清+DMEM／F12组神经球周边可见明显的细胞突起，呈放射状向周围伸出，而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小，随着培养时间的延长，各组的细胞突起均逐渐伸长，3个实验组分化能力低于对照组，与阴性对照组之间无明显差异。结论：GM-1能够维持神经干细胞的原始神经状态，促进神经干细胞的增殖，对神经干细胞无明显的诱导分化作用。     

不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性

目的：观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响，并优化培养条件与方法。 方法：实验于2006-02／2006—04在吉林医药学院临床检验实验室进行。①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态，即对数生长期。将细胞分成密度相同的4个组。离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜，其终浓度依次为5％、10％、15％、20％分装于冻存管。冻存15d后，每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养。培养12h后吸取少量实验细胞，加入等体积的0．1％台盼蓝染液，5min后在血球计数板上计数，被染成深蓝色的细胞为死细胞；染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞。每个标本计数500个细胞，计数2次取平均值，计算细胞的复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞，采用2种不同的方法进行复苏。第1组：立即将冻存管置37℃水浴中，待融化后1000r／min离心5min，吸去上清液，加入含10％小牛血清的RPMI～1640培养基，混匀后接种于细胞培养板继续培养。第2组：将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱，融化后离心、加培养基等操作同第1组。复苏细胞培养12h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备3×10^4／mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中，每孔1mL，然后分别加入5％、10％、12％、15％、20％的灭活小牛血清，每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12，24，36，48，60，72，84，96h后每种浓度各取1孔计数细胞量，绘制细胞生长曲线。 结果：①5％、15％、20％二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10％二甲基亚砜组比较，差异显著（86．70％，82．03％，63．09％，88．13％，P均〈0．01）。②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率。与40屯溶解后37℃恒温方法比较，差异非常显?     

不同浓度地黄低聚糖对离体培养成年大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的影响

目的 观察不同浓度地黄低聚糖（RGOs）对离体培养成年大鼠骨骼肌成肌细胞（SMs）增殖的影响。方法 分离成年大鼠SMs，每日观察细胞的生长形态。第3代（培养10d后）的SMs行α-骨骼肌肌动蛋白免疫组化染色。用无血清培养液[Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）／F12]孵育原代培养3d的SMs 24h使细胞同步化，分别以RGOs终浓度为0（对照）、0．156、0．625、2．500和10．000g／L含体积分数为15％胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培养液培养，连续计数6d。从原代培养到细胞计数，整个过程分别重复3次，取平均值，观察不同浓度RGOs对SMs增殖的影响。结果 本研究方法分离的SMs经锥虫蓝染色显示成活率均在90％以上。原代分离提纯的SMsα-肌动蛋白（α—actin）染色阴性；传代2次后（距原代分离10d），α—actin染色阳性。RGOs可明显促进原代分离的SMs增殖，这种效应反映在指数增长期提前，细胞分裂数量增加，肌管融合速度增加，较低浓度（0．156～2．500g／L）时，促增殖效应呈剂量依赖性（P均〈0．05）；但给予高浓度（10．000g／L）时并不能进一步促进SMs增殖。结论 RGOs可以明显改变SMs生长特性，最适干预浓度为0．625g／L。有望为临床上心肌梗死的中西医结合细胞学治疗提供实验依据。     

人多发性骨髓瘤细胞系SKO-007 IL-6表达的研究

人多发性骨髓瘤(MM)细胞系SKO-007是新近建株于MM患者的骨髓瘤细胞,它是否自泌白细胞介素6(IL-6)尚未见报道。材料和方法1 细胞培养与样品收集将SKQ-007细胞(ATCC购置)悬浮于含10％灭活小牛血清(FCS)的RPMI 1640培养体系中,37℃、5％ CO_2条件下培养2～3天换液传代1次。试验前,收集细胞用无血清的RPMI 1640培养液洗涤两次,并饥饿4小时。再同法洗涤两次,收集末次洗涤液和1.5×10~7细胞作为培养0小时之样品。     

体外血清预培养促进神经干细胞增殖

背景：神经干细胞的临床应用前景广阔，寻找多种方法体外促进神经干细胞的增殖和分化为今后的发展方向。目的：介绍一种省时且经济的神经干细胞的培养方法。设计：观察对比实验。单位：北京市神经外科研究所。材料：选择4只孕14天Wistar大鼠，常温常湿环境饲养，体质量（180&;#177;20）g，均购自中国医学科学院动物所（实验动物许可证号码：SCXK1100—0006）。DMEM／F12（1：1）以及B27购自Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购自PeproTech公司；巢蛋白单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体购自Chemicon公司。胎牛血清购自Hyclone公司。方法：实验于2004—05／2004—10在北京市神经外科研究所损伤修复室完成。将Wistar大鼠脱臼处死，每次取4只胎鼠，将其脑组织置于Hank’s液中，解剖显微镜下剥离软脑膜及血管，眼科剪剪碎脑组织并收集细胞于2个离心管中离心，弃上清液。①根据给予血清预培养与否将细胞分成血清预培养组及对照组。血清预培养组细胞加入含100g／L胎牛血清DMEM培养液，培养48h后换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液；对照组细胞中直接加含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液，37℃．体积分数为0．05的CO2培养箱培养1周。通过相差显微镜观察血清预培养组对照组培养48h后神经干细胞的生长情况。②用100g／L胎牛血清诱导分化后的第5天和第10天行nestin、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体免疫荧光染色，采用荧光显微镜观察检测两组神经干细胞的表达；对照组采用PBS缓冲液替代一抗，其它步骤同血清预培养组。主要观察指标：①相差显微镜下观察血清预培养组及对照组神经干细胞培养48h后的生长状况。②免疫荧光染色检测两组神经干细胞的表达。结果：①血清预培养组细胞经培养48h后，出现大量较规则的神经干细胞球，多数细胞球由8-10个细胞聚集而成。改用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM／F12培养液后，细胞球增殖很快；对照组细胞培养48h后只有不规则片状块，4—5d后才出现规则的小细胞球。②荧光显微镜观察可见两组细胞的分化速度和分化方向相同，在诱导分化后的第5天，nestin、胶质纤维酸性蛋白、半乳酸脑苷为阳性，微管相关蛋白2为阴性；在诱导分化后的第10天，nestin和胶质纤维酸性蛋白为阳性，半乳酸脑苷和微管相关蛋白为阴性。结论：血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快，促进神经干细胞增殖。     

三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性

背景：采用不同方法评价材料的细胞毒性可能会得出不同的实验结果。目的：采用3种比色法评价镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛等牙科金属材料对小鼠成纤维细胞（L-929细胞）的细胞毒性。方法：以镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛4种牙科金属材料的浸提液分别作用于体外培养的L-929细胞24,72h。以体积分数10％小牛血清＋高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阴性对照组,以0.7％丙烯酰胺＋体积分数10％小牛血清＋高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阳性对照组,分别采用MTT、CCK-8及结晶紫3种比色法检测上述材料的细胞毒性。结果与结论：①4种材料浸提液中培养的细胞形态正常,胞内结构清晰,随着培养时间延长细胞大量增殖,与阴性对照组细胞形态无明显差异。阳性对照组细胞数量明显减少,形态完整性受破坏,形成大量细胞碎片。②培养24h时,CCK-8比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率低于阴性对照组沪〈0．05）,MTT及结晶紫比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）;培养72h时,MTT比色法检测中4种牙科金属材料组细胞相对增殖率低于阴性对照组（P〈0．01）,CCK-8及结晶紫比色法检测中4组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）,但材料细胞毒性均为0—1级。表明上述4种牙科金属材料细胞毒性均在临床应用的允许范围内,具有良好的生物安全性。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

Cardiac pathology in various in various pathogenetic subtypes of ischemic stroke

Heart pathology was studied in various pathogenetic subtypes of ischemic stroke. A total of 330 stroke patients were divided into 4 groups. Group 1 consisted of 104 (31.5%) patients with cardioembolic stroke, group 2--of 72 (21.8%) with hemodynamic, group 3--of 71 (21.5%) patients with atherothrombotic and group 4--of 83 (25.2%) patients with lacunar stroke. Cardiac pathology was found in all patients of group 1 (ischemic heart disease-50.0%, inflammatory-infectious lesions-27.9%, other lesions-22.1%), in 49 (68.1%) patients of group 2, 36 (50.7%) of group 3 and 31 (37.3%) of group 4. Ischemic heart disease was prevalent (85.7, 86.1, 83.9% vs group 1). Potential sources of cardiogenic cerebral embolia were found in patients of all the groups: 100, 62.5, 43.7 and 33.7%, respectively. Thus, most patients with ischemic stroke have different heart defects related to the subtype of ischemic stroke. Potential causes of cardiocerebral embolism can be detected in any subtype of ischemic stroke.     

Characterization of various anti-Pr cold agglutinins

Forty -one samples of anti-Pr cold agglutinins (CA) were studied. The titers ranged from 4 to 32,000. As is the case with cold agglutinins of other specificities, immunoglobulin class M and k-type light chains predominated with anti-Pr CA. On the other hand, the few IgM lambda, IgG, and IgA found were associated preferentially with anti-Pr specificity. All anti-Pr CA were inhibited by human red cell membrane sialoglycoproteins. On the basis of an increased inhibition by sialoglycoproteins after periodate oxidation and carbodiimide treatment, respectively, three anti- Pr2 and five anti-Pr3 were found. Among 24 anti-Pr1 CA subclassified on the basis of agglutination with dog red cells, six were anti- Pr1h, 16 were anti- Pr1d , and two did not fit into the subclassification. Similar to the anti- Pr1h , - Pr1d subclassification, anti-Pr3 CA could be subclassified into anti- Pr3h , - Pr3d. Three anti-Pra examples were found. None of the anti-Pr CA was inhibited by N-acetylneuraminic acid; some (5/35) were inhibited by sialyllactose, NeuAc alpha 2–3 2–6 Gal beta 1–4Glc, in high doses (5.0- 20.0 mM).     

人工听骨赝复物材料的特征

检索中国期刊全文数据库文献,对有关人工听骨赝复物资料进行整理,分析不同种类人工听骨材料在听力重建术中的应用.研究表明不同种类人工听骨材料各有优缺点.自体软骨,如耳屏软骨,鼻中隔软骨等作为听骨赝复物有取材方便,不易吸收的优点,但远期亦可出现变性和吸收.同种异体牙作为一种听骨赝复物材料,其来源广泛、组织相容性好、稳定性高、易长期保存、经处理后几乎不含有有机物质、排异反应很弱,而且牙的声传导性好,极易临床推广,但异体牙制各听小骨时,易于脱落,不被大多数耳科医生所接受.钛质听骨赝复物生物相容性和组织亲合性好、无毒性、耐腐蚀、重量轻、与镫骨连接牢固、不易脱位,术后听力提高幅度大,疗效显著.生物陶瓷赝复物,由于它含有类似正常骨的无机盐成份,生物相容性好,脱出率低,在耳外科得到广泛应用.随着对生物材料研究的不断深入及新材料的发现,许多学者设计了多种复合听小骨,可以充分结合各种材料的优势,避免劣势.