大鼠肝细胞的微载体粘附培养

为探讨简便、实用、长期培养肝细胞的有效方法，以Ｃｙｔｏｄｅｘ ３为材料，对Ｗｉｓｔａｒ大鼠肝细胞进行微载体粘附培养。     

微载体培养人肝细胞在混合型生物人工肝系统上的应用

目的　探讨微载体培养L 0 2人肝细胞株应用于混合型生物人工肝系统 (HBLS)及其治疗实验效果。方法　采用微载体Cytodex 3培养人肝细胞 ,经简易体外灌流实验后装配成HBLS ,用于治疗急性肝衰犬 ;观察模型犬的临床体征、生存时间、生化指标以及死亡后各脏器的病理检查。结果　HBLS治疗组和对照组的平均生存时间分别为 (7 9± 2 3)h和 (3 4± 1 4 )h ,差异具有显著性 (P <0 0 5 ) ;空舱对照组生化指标呈现进行性恶化趋势 ,而HBLS组治疗过程中 ,FBI上升 ,TBIL、ALT、AST、LDH、PT指标呈下降趋势 ;肝组织的病理显示治疗组较对照组肝细胞变性坏死程度减轻。结论　微载体培养L 0 2人肝细胞株成功应用于HBLS ,能改善急性肝衰犬的状态 ,延长生命 ,具有一定的安全性和有效性。     

微载体培养L02人肝细胞应用于生物人工肝的初步研究

Ｌ0 2人肝细胞株组织学来源为人正常肝组织 ,具备一定正常肝细胞的生物功能。我们将高密度微载体培养的Ｌ0 2人肝细胞聚集体加入中空纤维生物反应器 ,构建简易体外生物人工肝装置并进行初步的应用研究。一、材料与方法1.材料 :Ｌ0 2人肝细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所 ;Ｃｙｔｏｄｅｘ3微载体为Ｐｈａｒｍａｓｉａ公司产品 ;聚羟乙基异丁烯酸 (Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ )及ＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ12培养基均为Ｓｉｇｍａ公司产品。2 .Ｌ0 2人肝细胞的微载体培养 :( 1)取 1.4ｇＣｙｔｏｄｅｘ 3,水化处理[1] ;( 2 ) 12 %Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ…     

大鼠肝细胞的微载体黏附培养及其功能测定

目的 探讨一种简单获取大量高活性肝细胞的培养方法。方法 用半原位酶消化技术对ＳＤ大鼠肝细胞进行分离与微载体黏附培养,连续观察肝细胞的形态。检测肝细胞的白蛋白分泌功能和葡萄糖合成功能,并同时与贴壁培养的肝细胞比较。结果 黏附培养的肝细胞存活率,白蛋白分泌功能,葡萄糖合成功能都保持较高水平,优于贴壁培养的肝细胞。结论 微载体培养提供长时间保持高活性,高密度生长的肝细胞,为肝细胞移植,肝病防治以及生物人     

微囊包载体肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响

目的：探讨采用海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠（ACA）微囊包裹微载体的肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响。方法：设立微囊包载体组和普通单层细胞培养组;以微载体Cytodex3进行肝细胞（HL-7702）培养;选择合适时机进行ACA微囊化包裹。收集两组第1～6天的培养液,测定其中白蛋白及乳酸脱氢酶（LDH）含量;并用Calcein-AM/PI双染细胞,在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度变化,了解细胞活性的改变。结果：观察培养6d,微囊包载体组培养液中的白蛋白含量至第4天达到峰值,之后缓慢下降;而普通单层培养组培养液中白蛋白含量至第2天达到峰值,之后迅速下降。微囊包载体组培养液的LDH含量明显低于单层培养组（P〈0.01）。微囊包载体组中活细胞的绿色荧光强度逐渐减弱,至培养第6天,显示黄绿色荧光;而单层培养组中每天有大量失活细胞悬浮于培养液中,至培养第6天,贴壁细胞数量仅占培养前的27%。结论：微囊包载体肝细胞培养方式中前期,微载体细胞培养可在较短的时间及较小的空间内实现细胞扩增;外周的微囊机构对肝细胞营养物质的供给及合成产物的排出无影响,但可阻挡大分子免疫球蛋白;两者结合有利于维持肝细胞的白蛋白分泌功能及细胞活性,是一种兼具高密度培养及免疫屏障功能的细胞培养方式,在生物人工肝中有一定的可行性。     

Cytodex-3微载体高密度培养人肝细胞系CL-5

目的采用微载体进行高分化的人肝细胞系CL－5的高密度培养以作为生物人工肝的生物材料。方法进行CL－5的微载体均匀搅拌培养,于培养的1、3、5、7、9天进行细胞计数及培养上清人白蛋白浓度检测,并在显微镜下动态观察细胞生长情况。结果细胞密度于培养的第七天达最高峰为1.98×10~9／L,同时人白蛋白的分泌亦最高,为54.79μg。结论实验表明使用Cytodex-3微载体培养CL-5肝细胞系,可达到较高的密度,并且具有一定的分泌功能。     

新型微囊系统体外培养原代肝细胞的研究

目的 探讨一种新型微囊系统以体外培养原代肝细胞。方法 使用新型微囊系统体外培养大鼠原代肝细胞，检测微囊系统各项特性，检测肝细胞的生存率、尿素合成和白蛋白合成功能。结果 做囊具有良好的通透能力，白蛋白可自由通过，具有一定的机械稳定性，并具有良好的免疫保护能力，分子量在150kD以上的物质不能进入做囊，肝细胞在微囊内保持较高的活性和功能，其尿素合成和白蛋白合成功能比对照组高1～3倍。结论 此微囊具有良好的牛物和机械特性，可以在生物性人工肝和细胞移植中发挥重大作用。     

微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究

目的 为提高人肝细胞系的培养效率和细胞获取数量。方法 本研究采用微载体细胞培养技术进行了人肝细胞系CL-1的高密度培养，动态观察细胞生长，检测肝细胞特异性功能变化。结果 CL-1在微载体Cytodex-3上生长良好，于培养的第7天达到高峰，细胞数量为2.13×10^8／100ml，白蛋白合成量71．23μg／100ml．尿素合成量23．32mg／100ml，安定转化量619．7μg／100ml，与CL-1普通培养结果比较，细胞产量是普通培养的49．3倍．而白蛋白合成量、尿素合成量及安定转化量则分别是普通培养的39．8倍、41．6倍和33．3倍。结论 微载体培养CL-1可提高培养效率和细胞数量．且具有较好的功能，微载体高密度培养CL-1可作为组合型人工肝的生物材料。     

玻璃化法保存微囊化大鼠原代肝细胞的研究

目的：探讨采用玻璃化法低温保存微囊化肝细胞的效果，优化最佳冷冻条件。方法：使用33%，37%，40%3种不同浓度的乙二醇保护剂，以不同的冷冻速度低温保存微囊化的肝细胞，并检测冷冻后微囊内的肝细胞功能。结果：40%乙二醇浓度的保护剂配方能最有效保护肝细胞，3种冷冻速度的冷冻效果相同，冷冻后肝细胞P450功能和尿素合成功能与冷冻前相同。结论：玻璃化法能够有效的保存微囊化的肝细胞。     

bFGF壳聚糖微球的制备及检测

目的探讨以壳聚糖为载体、采用乳化交联法制备的bFGF壳聚糖微球体外释放特性,为下一步实验奠定基础。方法应用0.6%三聚磷酸钠溶液作为交联剂,1.5%壳聚糖溶液作为载体,采用乳化交联法制备bFGF壳聚糖微球。激光粒度及Zeta电位分析仪检测微球粒径分布,扫描电镜观察形态;ELISA法计算bFGF壳聚糖微球载药量、包封率及体外释药规律。结果 bFGF壳聚糖微球粒径为20.312～24.152μm;扫描电镜观察显示微球表面光滑圆整,无明显孔隙,分布均匀,分散性好。载药量和包封率分别为(7.57±0.34)mg/g及95.14%±1.58%。bFGF壳聚糖微球可持续体外释放bFGF 24 d;bFGF浓度随时间延长逐渐升高,第24天达(820.45±21.34)ng/mL;微球体外释药具有突释效应,突释率为18.08%,24 d累计释放率为82.05%。结论乳化交联法制备bFGF壳聚糖微球操作简便,微球表面光滑、分布均匀,分散性好,载药量和包封率均较高,体外释药较稳定且释放率较高,是一种较理想的制备bFGF壳聚糖微球的方法。     

皮肤成纤维细胞在生物反应器中的生长和扩增

目的　探讨皮肤成纤维细胞在生物反应器中批式和间歇换液培养过程的生长、扩增与代谢特性。方法　将幼儿包皮组织中分离皮肤成纤维细胞接种到含 5 mg/ ml微载体浓度的 1.5升 Celli Gen生物反应器中 ,测定在间歇换液培养和批式培养过程中细胞生长密度、葡萄糖消耗及乳酸生成 ,同时与方瓶和转瓶中间歇换液培养结果进行比较。　结果　在生物反应器间歇换液培养过程中 ,成纤维细胞生长的最终密度达到 2 .0 8× 10 6 / ml,扩增 2 9.7倍 ,是批式培养的 1.81倍。与间歇换液的方瓶和转瓶培养结果相比 ,由于消除了营养和贴壁表面的限制 ,细胞密度分别提高9.16倍和 1.4 3倍。　结论　利用生物反应器和微载体悬浮培养人皮肤成纤维细胞 ,是大量制备组织工程种子细胞的一种有效方法。     

壳聚糖在软骨组织工程中的应用

目的 对高分子生物材料壳聚糖在软骨组织工程中的应用现状进行综述。方法 广泛查阅近年来有关壳聚糖在组织工程中应用的文献，综合分析，讨论 其生物相容性、可降解性及其应用。结果 壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，除能提供细胞生长所需的三维支架作用外，还能提供类似软骨基质的细胞外环境，维持细胞表型及功能。结论壳聚糖在软骨组织工程中具有良好的应用前景。     

培养基钙浓度对复方壳多糖组织工程皮肤基底膜构建的形态学研究

目的寻找最适于组织工程皮肤生长及基底膜构建的体外培养基钙浓度。方法按照鲁元刚等建立的方法制备复方壳多糖组织工程皮肤，根据培养基钙浓度不同，分为1．00、1．45、1．65和1．95mmol／L四组。在37℃、5％CO2及90％以上湿度孵箱内浸没培养3d后，将培养物置于不锈钢筛网上进行气一液界面三维培养，每天换液1次。培养7、15d，行HE、PAS染色观察组织工程皮肤的组织学特性；并利用免疫组织化学染色对基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原进行观察，评价基底膜构建情况。结果各组组织工程皮肤组织学观察类似正常皮肤，有分化良好的表皮和致密真皮，但1．95mmol／L组表皮分化较其他组更好；1．00、1．45及1．65mmol／L组角化层外侧常伴未角化的角质形成细胞，1．95mmol／L组表皮细胞角化完全，且与颗粒层细胞结合牢固。PAS染色显示各组真、表皮间有紫红色带状结构；免疫组织化学染色显示真皮与表皮间Ⅳ型胶原反应呈阳性，且1．95mmol／L组阳性反应强于1．00mmol／L组。结论钙浓度为1．95mmol／L的培养基最适合于复方壳多糖组织工程皮肤生长及基底膜构建。     

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女损赠的胎儿骨骼肌标本,参照Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经美速贴壁法纯化后,在含20％胎牛血清的生长培养基中培养,以生长曲线评价及其增殖情况;含5％胎牛血清的融合培养基中培养,以磷酸肌酸激酶－MM型合成量及成肌细胞融合率评价及其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法（小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体）鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性,能合成磷酸肌酸激酶,能融合形成肌小管,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4．8天,在融合培养基作用下,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞,所得细胞增殖能力强,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白;融合培养基能促进其体外分化。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的移植研究

目的 探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。方法 应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(AS)组、壳多糖膜覆盖物(CH)组及对照组，术后进行大体观察，并在3、7、14和21天应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监泅。结果 AS组在移植第3天，组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长入移植物，皮肤移植钧颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化征象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成分增多；第14天，创面基本愈合，修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，短痕小，无需进行二次植皮。CH组至移植第14天，结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深；第21天创面愈合，遗留较大短痕，与正常皮肤区分明显，而对照组的结痴脱落，创面大而深，颜色深红。结论 以壳多糖为基质网架构建的组织工程化皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

几丁糖影响体外细胞生长的实验研究

用不同剂量的几丁糖溶液分别加入人成纤维细胞和表皮角化细胞于细胞培养液中,培养72小时,测定细胞数。结果:人成纤维细胞数随着几丁糖溶液剂量的增加而减少;人表皮角化细胞数随着几丁糖溶液剂量的增加,在一定范置内相应增加。从而肯定丁几丁糖溶液能抑制人成纤维细胞生长,促进人表皮角化细胞生长。     

高黏度温敏性几丁聚糖水凝胶的制备及特性初步研究

目的 改进制备工艺，提高几丁聚糖，甘油磷酸钠水凝胶（chitosan／glycerol phosphate。C／GP）的黏度，以期拓展其应用范围。方法采用改进的消毒方法，即将几丁聚糖单独进行高压蒸汽消毒，制备高黏度温敏性C／GP（highviscousC／GP,HV-C／GP）。并采用常规方法制备C／GP。Gemini流变仪动态检测HV-C／GP、C／GP流变学变化，评估黏度提高以后材料的初始黏度、胶凝温度和胶凝时间变化。将凝胶化的两种材料，放入PBS液中，于0、1、2、5、10和25d取出，干燥称重，计算失重率，比较两种材料的体外降解情况。采用扫描电镜观察两种材料的超微结构。结果脱乙酰度91％的C／GP初始黏度为1．81Pas，而HV-C／GP为17．24Pas，后者较前者提高了近10倍。C／GP的胶凝温度为37℃，HV-C／GP为34℃：在胶凝温度下，两者的胶凝时间约为5min。0．5mLHV-C／GP和C／GP凝胶化后第1天，失重率分别约为72．5％和55．4％，此后质量逐渐降低，至第25天分别为90．8％和78．2％。扫描电镜下两种材料均可以观察到多孔网络结构，C／GP孔径为50～100μm，HV-C／GP孔径为30～50μm，后者较前者明显缩小。结论通过改进消毒方法制备的HV-C／GP黏度明显提高，但温敏性变化不大；降解时间有所延长；扫描电镜观察可见多孔网络状结构，且孔径减小。     

可生物降解止血粉的制备及其止血性能

目的采用壳聚糖(chitosan,CTS)为主要材料制备一种可生物降解止血粉并观察其止血性能。方法以可降解的天然有机高分子材料CTS为主材,海藻酸钠(alginate,ALG)为辅料,通过乳化交联工艺,制成一种结构疏松的微球。利用单颗粒光学传感技术测定微球粒径,扫描电镜观察干燥微球的超微结构,将其置于伤口渗出液中浸泡,分别于1、3、5、10、20、30和60min后测定微球溶胀率。以云南白药为对照,在6只新西兰兔的脾出血模型,随机使用CTS/ALG微球和云南白药进行止血,观察止血效果。结果乳化交联法工艺稳定,CTS/ALG微球形态圆整,粒度均匀,粒径为2～20μm,平均粒径为4.05±2.55μm。干燥态CTS/ALG微球呈白色粉体状,结构疏松,扫描电镜下可见其呈珊瑚状外观,表面布满皱折。CTS/ALG微球的溶胀率,5min时达280.139%。在兔的脾出血模型上CTS/ALG微球组的出血时间为2.83±0.17min,云南白药组为5.33±0.49min,止血效果明显优于云南白药组(P<0.01)。结论以CTS和ALG为材料制备的CTS/ALG微球止血性能良好,使用方便,是一种新型的粉体止血剂。     

以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法，为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础，并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织，分别以DispaseⅠ消化液和混合消化液消化成单细胞悬液，以差速贴壁法排除成纤维细胞，接种后以L929细胞为滋养层细胞进行培养，定期换液，细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代。细胞进行常规HE染色、流式细胞仪检测，以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组(n=20)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片，n=20)及阴性对照组(成纤维细胞铺片，n=20)行免疫组织化学染色。结果 原代培养10天左右细胞逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞，生长期内均为单一的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长，细胞可传11～13代，成活50～60天。结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持增殖活力，为构建组织工程化尿道奠定了基础，且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。