共表达pcIL-18/MAGE-1 DNA疫苗对JEG-3细胞HLA-G基因表达的影响

目的观察共表达基因疫苗pc IL-18/MAGE-1对绒癌JEG-3细胞株HLA-G基因表达的影响,探究pc IL-18/MAGE-1抗肿瘤作用机制。方法应用构建的共表达pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠,同时设阴性对照组和空白对照组,免疫后分别收集脾细胞,作用于靶细胞JEG-3,应用FCM检测小鼠T细胞亚群情况及NK细胞活性,MTT法检测肿瘤特异性CTL对靶细胞的杀伤率,RT-PCR法检测HLA-G基因表达情况。结果免疫组HLA-G基因表达降低,且对JEG-3细胞杀伤活性增加,与对照组比较,差异显著(P<0.05)。免疫组NK细胞活性及CD4+/CD8+、CD8+、CD4+值均高于对照组(P<0.05)。结论共表达基因疫苗pc IL-18/MAGE-1通过降低HLA-G基因的表达,进而增加NK细胞活性以及诱导肿瘤特异性CTL直接杀伤肿瘤细胞,发挥抗肿瘤作用。     

pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫荷瘤小鼠抑瘤作用

目的观察pcIL-18-MAGE-1基因疫苗对MAGE-1(+)及MAGE-1(-)荷瘤小鼠的成瘤情况和生存时间的影响。方法将稳定表达MAGE-1基因的Hepal-6-MAGE-1细胞,接种于C57BL/6J小鼠,制备MAGE-1(+)荷瘤鼠,利用Hepal-6细胞制备MAGE-1(-)荷瘤鼠,实验设为pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫组、阴性对照组及空白对照组,观察各组小鼠成瘤时间,肿瘤形成率、生长速率,抑瘤效果及生存期;应用HE观察瘤体病理改变。结果 MAGE-1(+)及MAGE-1(-)荷瘤小鼠的成瘤效果较一致,致瘤性检验差异无显著性(P>0.05);HE结果显示瘤体肿瘤细胞排列不规则,可见核分裂;疫苗免疫组成瘤率,生长速率均小于对照组,差异显著(P<0.05)。成瘤时间、生存时间长于对照组(P<0.05),MAGE-1(+)荷瘤鼠免疫组与MAGE-1(-)荷瘤鼠免疫组比较,抑瘤效果显著(P<0.05)。结论 pcIL-18-MAGE共表达基因疫苗对荷瘤鼠具有一定抗肿瘤作用。     

共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的 研究HIV-1CN融合基因与IL-2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法 脂质体介导共表达中国流行株HIV-1gag-gp120基因与IL-2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果 杀伤实验结果证明,经基因免疫获得的 CTL效应细胞,可杀伤 HIV-1CN 融合基因转染的靶细胞。结论 pGPIL-2可有效地诱导 CTL的产生,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。     

从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用分析

目的观察经IL-2/IL-15/SCF诱导的CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞体外扩增能力、NKG2D表达变化及其对肝癌细胞的杀伤作用。方法应用免疫磁珠分选法(MACS)从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8等方法比较IL-2/IL-15/SCF对NK细胞扩增倍数、NKG2D表达及对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞株杀伤活性的影响;同时观察封闭NKG2D受体对CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞杀伤活性的影响。结果 IL-2/IL-15/SCF培养14 d后,CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞扩增倍数、NKG2D表达以及对HepG2和SMMC-7721的杀伤活性显著增强,与对照组、IL-2组和IL-15组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。NKG2D单抗可以下调其对HepG2细胞的杀伤效应,但对SMMC-7721的杀伤无明显影响。结论 IL-2/IL-15/SCF诱导后CD3~-CD56~+CD16~+ NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性增强,NKG2D途径是NK细胞杀伤肝癌细胞的重要机制之一。     

CIK细胞及其中穿孔素在抗肿瘤中的作用

细胞免疫比体液免疫在抗肿瘤效应中发挥着更重要的作用.细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的作用机制已较清楚,主要是通过细胞直接杀伤和分泌抗肿瘤细胞因子两种途径.在抗肿瘤的细胞免疫应答中CTL及NK细胞起着重要作用.CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3,McAb,IL-2,IFN-γ,IL-1α)共同培养诱导后获得的一群异质细胞.由于该细胞同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点.     

恶性疟原虫FCC-1/HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠后的免疫反应

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗 ,探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒 pc DNA 3-EBA175 / HRP 经骨骼肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒 pc DNA3- Pfs2 5混合注射免疫 Balb/ c小鼠。对小鼠的骨骼肌进行预处理 ,即于注射前 7d在左后肢股四头肌注射 0 .5 %盐酸布比卡因 5 0μl,注射深度为 2 m m。观察免疫后不同时间点小鼠血清 Ig G抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4+ / CD8+ T细胞亚群比率和 NK细胞杀伤活性的变化。结果显示 ,pc DNA3- EBA 175 / HRP 单独肌肉注射或与 pc DNA3- Pfs2 5混合肌肉注射免疫小鼠 ,均可见血清 Ig G抗体滴度增高、经恶性疟原虫抗原刺激后的特异性 T淋巴细胞增殖反应增强、CD4+ / CD8+ T细胞比率下降以及 NK细胞杀伤活性增强 ;加强免疫注射机体的免疫反应能增强。提示肌肉注射 DNA疫苗为一有效的免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫两个基因的重组质粒单独免疫或与编码不同阶段基因的重组质粒混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫和 NK细胞杀伤活性     

恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答

目的　观察用恶性疟原虫复合抗原基因 HGFSP构建的 DNA疫苗 pc- HGFSP免疫小鼠诱导的细胞及体液免疫应答。　方法　用 pc- HGFSP肌注免疫 C5 7BL/6小鼠并加强免疫 2次 ,取小鼠脾淋巴细胞及血清测定 :脾淋巴细胞增殖活性 (MTT法 ) ;NK细胞活性和 CTL活性 (L DH法 ) ;脾脏 CD4 +及 CD8+ T细胞亚群 (免疫荧光法 ) ;血清 pc- HGFSP抗原特异性抗体 (EL ISA法 )及一氧化氮 (NO)含量。　　结果　与 pc DNA3对照比较 ,pc- HGFSP免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性增高 2 4 %～ 37% ;NK细胞活性增高 38%～ 90 % ;CTL 活性增高 6 5 %～ 15 3% ;CD8+ T细胞亚群增加。免疫血清产生HGFSP抗原特异性 Ig G抗体 ;NO含量也有所增高。　结论　恶性疟 DNA疫苗 pc- HGFSP有一定的诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答的作用。     

腺病毒载体介导人血管内皮细胞生长因子受体-2诱导抗小鼠肝癌免疫

目的 探讨复制缺损型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hKDR)诱导抗小鼠肝癌血管免疫、打破免疫耐受的效果. 方法 用RT-PCR方法从人脐静脉内皮细胞和小鼠胚胎细胞中分别克隆hKDR和小鼠KDR(mKDR),构建Ad hKDR和Ad mKDR.用Ad hKDR和Ad mKDR分别皮内免疫C57BL/6小鼠,7 d后取脾细胞作为效应细胞,Hepa 1-6/mKDR作为靶细胞,行乳酸脱氢酶释放试验,检测特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤率;免疫小鼠接种Hepa 1-6肝癌细胞,观察荷瘤小鼠成活情况. 结果 Ad hKDR和Ad mKDR分别免疫小鼠1周后,在效应细胞:靶细胞为100:1、50:1和25:1时,Ad hKDR诱导的6 h CTL杀伤率分别为84.3%±6.7%、71.5%±5.2%和44.6%±4.7%;Ad mKDR诱导的6 h CTL杀伤率分别为65.2%±6.1%、46.7%±5.0%和22.6%±3.7%.Ad hKDR免疫小鼠后l周接种5×106个Hepal-6肝癌细胞,2个月后仍然有60%的小鼠无瘤生长;而接种2×106个Hepa 1-6细胞至Ad mKDR免疫小鼠,2个月后小鼠成活率为40%.上述CTL效应和肿瘤保护作用在清除CD8+和CD4+T淋巴细胞后消失. 结论 Ad介导异种KDR能有效地打破肿瘤的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD8+和CD4+T淋巴细胞依赖性的.     

共表达HIV—1的gag—gp120与IL—2的pGPIL—2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的：研究HIV－1CN融合基因与IL－2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法：脂质体介导共表达中国流行株HIV－1gag-gp120基因与IL－2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK－21细胞，以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞，检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果：杀伤实验结果证明，经基因免疫获得的CTL效应细胞，可杀伤HIV－1CN融合基因转染的靶细胞。结果：pGPIL-2可有效地诱导CTL的产生，该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。     

结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

目的研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、流式细胞仪计CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。结果MPT64基因免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖显著,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+细胞和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显。结论MPT64 DNA疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗的组分。     

弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护性

目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒。ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定免疫鼠脾脏NK细胞杀伤率;流式细胞仪测定T细胞亚群;用弓形虫速殖子腹腔攻击感染小鼠,观察小鼠的生存时间。结果SAG1-SAG2组小鼠IgG抗体、IFN-γ、IL-2及CD4 /CD8 细胞比例均高于SAG1组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合DNA疫苗组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗较SAG1单基因疫苗具有更好的免疫保护性。     

白细胞介素-15重组体对HBsAg核酸疫苗的免疫佐剂作用

白细胞介素-15(IL-15)属螺旋结构细胞因子家族，它能促进T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞增殖及分化；具有诱导淋巴细胞产生γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子α的作用。IL-15与疫苗共同免疫时可刺激抗体产物增加，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性加强。将IL-15表达质粒与HBsAg DNA疫苗共同免疫小鼠，以观察其对小鼠免疫应答的影响。     

IL-12及HBV基因疫苗共同免疫小鼠的效果

目的观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响.方法肌肉注射DNA疫苗,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性.结果免疫8wk后,注射pCR3.1组、注射pCR.1-S组及共注射IL-12真核表达载体的血清A(OD值)分别为0.04±0.01,0.87±0.1及1.67±0.15.CTL细胞杀伤活性分别为10.1%±6.4%,50.5%±6.4%及73.3%±8.8%,后两组与pCR3.1组比较均有显著差异(P＜0.01),后两组比较均有显著差异(P＜0.01).脾细胞悬液经抗CD4+单克隆抗体处理后分别为48.3%±5.9%,75.6%±9.1%,抗CD8+单克隆抗体处理后分别为10.6%±1.4%,16.9%±2.3%.结论 IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行.基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染.     

不同肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导CTL活性的研究

目的比较不同方法提取的肝癌细胞(SMMC-7721)抗原致敏树突状细胞(Dendritic cell DC)后,对特异性细胞毒性T细胞(CTL)的诱导作用。方法分离脐带血单个核细胞,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出脐血DC;SMMC-7721细胞经反复冻融,直接超声破碎及热休克处理后再超声破碎细胞三种方法提取肿瘤抗原,然后分别致敏DC,以MTT法检测脐血DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。结果热休克处理后再超声破碎法提取的抗原致敏DC,能诱导更强的刺激T细胞增殖的能力,并且可以诱导更强的CTL活性。结论加热处理后再超声破碎细胞提取的肿瘤抗原致敏DC,在体外可诱导强大的抗肿瘤免疫保护效应。     

白藜芦醇在人γδT细胞杀伤肝癌细胞中的作用研究

目的探讨白藜芦醇对人外周血γδT细胞体外增殖及该细胞对肝癌细胞SMMC-7721细胞活性的影响。方法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),放入含有IL-2、帕米膦酸的RPMI 1640培养基进行培养并诱导γδT细胞,实验组给予白藜芦醇共同培养,对照组不加药物,在此基础上,两组均加入肝癌细胞SMMC-7721作为靶细胞,继续培养。在培养第10天后,用台盼蓝染色计数细胞,采用流式细胞术检测各组γδT细胞的纯度及其颗粒酶B和CD107a、穿孔素的表达;用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤效应。结果两组γδT细胞纯度均达到70%以上,实验组γδT细胞较对照组纯度显著更高(P0.01);且实验组γδT细胞扩增倍数,穿孔素、CD107a和颗粒酶B的表达及对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应均显著高于对照组(P0.01)。结论白藜芦醇能促进γδT细胞增殖,并可能通过上调颗粒酶B和穿孔素的表达增强其对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应。     

丙型肝炎病毒包膜基因对核心基因DNA疫苗免疫应答强度的影响

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)包膜基因E1E2对核心基因C DNA疫苗诱生的免疫应答作用。方法 将包含HCV C或CE1E2基因片段插入真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pHCV-C或pHCV-CE1E2,分别免疫Balb/c小鼠,每间隔2wk加强免疫1次,同时剪尾取血。ELISA法检测免疫小鼠血清中HCV C特异性抗体的水平。以pHCV-C转染并表达HCcAg的BLAB/c小鼠骨髓瘤Sp4/0细胞为靶细胞,采用~(51)Cr释放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果 两个实验组20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当效/靶细胞比例为100:1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组(p<0.01);而pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异(p>0.05)。结论 E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

肝病患者外周血白细胞介素Ⅱ活性水平及其与自然杀伤细胞活性的关系

白细胞介素Ⅱ(IL-2)是一种由T细胞产生的淋巴因子,它具有增殖因子、分化因子、效应细胞活化因子和淋巴因子诱导因子的机能。作为分化因子,IL-2可促进细胞毒T淋巴细胞前身分化为细胞毒T淋巴细胞(CTL)。作为效应细胞活化因子,IL-2能活化自然杀伤(NK)细胞,而CTL和NK细胞均具有抗肿瘤、抗病毒作用。近年来对     

P356-1Y2L表位刺激BALB/c小鼠的特异性抗肿瘤免疫

目的检测MAGEC2衍生的免疫原性肽在小鼠体内抗肿瘤免疫效果。方法测定P356-1Y2L免疫BALB/c小鼠后诱导CTL以及分泌IFN-γ的能力,用MAGEC2衍生的表位免疫荷瘤小鼠,检测其抑制肿瘤生长的能力及观察小鼠的生存能力。结果 P356-1Y2L免疫BALB/c小鼠引发CD8~+T淋巴细胞的强烈增殖和活化,且能分泌较多的IFN-γ,并且可以有效的杀伤靶细胞。用P356-1Y2L免疫荷瘤小鼠,能够抑制小鼠肿瘤生长并延长小鼠的生存期。结论免疫原性肽P356-1Y2L能够在BALB/c小鼠中引发特异性CTL反应,成为癌症治疗性多肽疫苗的候选表位。     

携带结核杆菌Ag85B靶细胞的构建、鉴定及应用

目的构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的靶细胞以便评定结核疫苗的特异性细胞毒(CTL)作用。方法将携带有Ag85B基因的重组质粒pTB30s转入小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫组化染色法鉴定阳性克隆细胞胞内的Ag85B基因转录和蛋白表达水平;同时,用接种过BCG,pTB30s或生理盐水(NS)小鼠脾脏单个核细胞作为效应细胞,G418高压筛选的阳性克隆细胞为靶细胞,用MTT法检测各组CTL杀伤活性。结果RT-PCR以及免疫组化结果显示,阳性细胞能稳定表达Ag85B。CTL杀伤实验:BCG、pTB30s及NS对照组杀伤率分别为28.14%、45.18%和5.13%。结论含有Ag85B靶细胞构建成功及应用,为研究结核疫苗的免疫效果提供了较好的研究手段。     

4种甲胎蛋白抗原表位肽段致敏树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤效应比较

目的 通过体外杀伤试验,比较4种人肝癌特异性甲胎蛋白抗原表位肽段PLFQVEPV[hAFP(137～145)],FMNKFIYEI[hAFP(158～166)]、GLSPNLNRFL[hAFP(325-334)]和GVAL,QTMKQ[hAFP(542～550)]修饰树突状细胞(DC)后诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人肝癌细胞的特异性杀伤效应. 方法 选取健康人外周血单个核细胞,体外诱导成熟DC;合成4种hAFP抗原表位肽段分别修饰和诱导DC,体外刺激CTL,通过流式细胞仪法和细胞毒性检测法检测该修饰后的DC所诱导的CTL在体外对肝癌细胞株SMMC-7721细胞的杀伤作用.组间比较应用t检验进行统计学分析. 结果 4种人肝癌特异性甲胎蛋白片段均能在体外修饰和诱导DC细胞的增殖和成熟;这些成熟DC在体外均能诱导特异性CTL,CTL对SMMC-7721细胞均可产生杀伤效应.其中FMNKFIYEI[hAFP(158～166)]肽段诱导的CTL在效靶比分别为80:1、40:1及10:1时对肿瘤细胞的杀伤效应分别达到了78.1%±9.8%、43.9%±5.9%和28.2%±4.9%,比其他3种肽段的杀伤效应高(P<0.05). 结论 短肽段具有单独体外诱导特异CTL的作用,其诱导效果和杀伤效果均优于完整hAFP蛋白,其诱导的CTL有特异地杀伤SMM C-7721细胞的作用.