HCV5‘NCR和结构蛋白编码序列的克隆及对PA317细胞的转染

目的 进一步研究丙型肝炎病毒５‘ＮＣＲ对结构蛋白编码基因的表达调控。方法 以拼接好的ＨＣＶ５’ＮＣＲ〈Ｃ，Ｅ１和Ｅ２／ＮＳ１区基因共长２５４７个核苷酸片段克隆于逆转录病毒载体ＬＮＳＸ得重组体ｐＬＨＣ２５４７，用聚合酶锭反应（ＰＣＲ）及核苷酸序列分析等方法对重组体进行鉴定。通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法把经鉴定的重组体转染入ＰＡ３１７细胞，用Ｇ４１进行克隆筛选，以ＮＩＨ３Ｔ３细胞测其病毒滴度，提取转染细     

白细胞介素12对小鼠肝癌基因治疗的实验研究

目的：研究白细胞介素１２对小鼠肝癌细胞基因治疗效果。方法：利用脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）及脊髓灰质炎（Ｐｏ－ｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）,连接ｍＩＬ－１２ Ｐ４０及ｐ３５ ｃＤＮＡｓ和筛选基因新霉术磷酸转移酶（ＮｅｏＲ）,克隆至逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ中,使三个基因同时受逆转录病毒载体５’端ＬＴＲ启动子控制,转录至同一ｍＲＮＡ转录本上,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２转染包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆（命名为：Ｍ４５／ｍＩＬ－１２）,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３测定病毒滴度。然后用重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定。将６０Ｃｏ照射（６０ Ｇｙ）Ｍ４５／ｍＩＬ－１２细胞对荷瘤小鼠进行瘤内接种,每周一次,连续治疗三次,观察其治疗效果。结果：病毒上清中重组逆转录病毒滴度为５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ。 ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ证明外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,以及外源基因在ｍＲＮＡ水平上的表达。     

重组丙型肝炎病毒基因转染H9细胞模型的建立

目的：建立重组ＨＣＶ基因转染的Ｈ９细胞（人ＣＤ４，Ｔ细胞）模型。方法：以载体ＣＤＺ２（连接有１６９３ｂｐＨＣＶＤＮＡ，包括完整的ＨＣＶ结构区）为模板，通过ＰＣＲ获得高保真的１．７３ｋｂＤＮＡ片段（包括１６９３ｂｐＨＣＶｃＤＮＡ和部分载体ＤＮＡ序列），其特异性被ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实。将ＨＣＶｃＤＮＡ片段插入载体ｐＣＤ－ＳＲα，经菌落原位杂交以及酶切分斤和ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｏＩｔ筛选，获得重组ＨＣＶ（ｐＣＤ－ＨＣＶ），并与ｐＳＶ２－ｇｐｔ载体共转染Ｈ９细胞。结果：从选择性培养基中筛选口阳性克隆细胞，经ＲＴ－ＰＣＲ．ｄｏｔＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证表明ｐＣＤ－ＨＣＶ在Ｈ９细胞中可进行复制、转录和表达，表达的约１．３×１０５大小蛋白具有ＨＣＶ抗原性。转染ｐＣＤ－ＨＣＶ的细胞培养至９０天时，仍可检测到ＨＣＶｍＲＮＡ和ＨＣＶ抗原。结论：建立ｐＣＤ－ＨＣＶ转染的Ｈ９细胞模型获得成功。     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周？…

目的体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）基因变异的生物学意义。方法 应用逆转 录病毒勒体ＰＸＴ１构建ＨＢＶ／Ｃ基因表达载体，并转染永生化人外周血Ｂ细胞使之稳定ＨＢｃＡｇ。结果 重组质粒ＰＸＴ１－ＨＢＶ／Ｃ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血Ｂ细胞ＰＣＲ鉴定含目的ＤＮＡ，流式细胞仪分析显示，约４７．４％的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论ＨＢＶ／Ｃ基因逆转     

Southern杂交证实患者中存在庚型肝炎病毒的感染

目的与方法 庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）基因组，为正链单股ＲＮＡ病毒，全长约９４００核苷酸左右，根据５′端非编码区基因序列设计合成巢式ＰＣＲ两对引物，逆转录－巢式ＰＣＲ扩增产物，经低融点琼脂糖凝胶电泳和柱层析纯化，获得高纯度ｃＤＮＡ扩增片段，用（长臂）光敏生物素标记上述ｃＤＮＡ片段，制备成ＤＮＡ生物素探针，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测转录后第一次ＰＣＲ扩张增大的ＤＮＡ片段，结果 证实ＰＣＲ扩增的ＨＧＶＲ     

腺相关病毒和人γ—干扰素基因重组体转染

目的 观察腺相关病毒和人γ－干扰素的重组体ｐＷＩＧ转染淋巴细胞及在细胞内表达情况。方法 将ｐＷＩＧ以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法转染人淋巴株Ｈ９,再分别用聚体酶链反应（ＰＣＲ）、逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）等方法在ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质水平研究该重组体导入细胞和在内表达的情况。结果 转染ｐＷＩＧ的Ｈ９细胞的ＤＮＡ和ＲＮＡ经ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测均有５０４ｂｐ的ＤＮＡ条带     

丙型肝炎病毒NS5b区与5'-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５ｂ区与５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）不同基因区ＲＮＡ检测结果的区别及临床应用价值。利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测１４８例肝炎患者血清ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因的ｃＤＮＡ,并与５’－ＮＣＲ基因区ｃＤＮＡ检测技术进行了比较。结果 ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因区ＲＮＡ检出率为２４．３％（３４／１４８）,５’－ＮＣＲ基因区ＲＮＡ检出率为３１．１％（４７／１４８）。Ｈ     

应用长片段PCR扩增全长HIV— 1DNA的研究

目的 探讨长征段ＰＣＲ（ＬＤ－ＰＣＲ）扩增特点,并将它用于对全长ＨＩＶ ＤＮＡ的研究。方法 应用ＬＴＤ（Ｕ５）／ＬＴＤ（Ｒ）,ＣＬ－ＮＳＣ／ＣＬ－ＮＥＦ和ｇａｇＡｌ／ｇａｇＡ２等不同引物,＾３２Ｐｇａｇ,ｐｏｌ,ｎｅｆ和ｔａｔ等为片段探针,对克隆有ＨＩＶ－１完整基因片段,部分基因片段的质粒和ＨＶＩ感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ进行扩增。结果 ＬＤ－ＰＣＲ对０．４－９ｋｂ的第     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达

目的　体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ） 基因变异的生物学意义。方法　应用逆转录病毒载体ｐＸＴ１ 构建ＨＢＶ／Ｃ 基因表达载体,并转染永生化人外周血Ｂ 细胞使之稳定表达ＨＢｃＡｇ。结果　重组质粒ｐＸＴ１ＨＢＶ／Ｃ 经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性,转染后的永生化人外周血Ｂ 细胞ＰＣＲ 鉴定含目的ＤＮＡ,流式细胞仪分析显示,约４７ ．４ ％ 的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论　ＨＢＶ／Ｃ基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中稳定表达,有利于系列研究ＨＢＶ／Ｃ基因变异的生物学意义。     

反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

为了解丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因调控方式、探索反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的体外抑制作用。构建了由ＨＣＶ５′非翻译区（５′ＵＴＲ）翻译启动报道基因－虫荧光素酶（ｌｕｃ）基因的真核表达载体；人工合成了针对ＨＣＶ５′ＵＴＲ及非结构蛋白５（ＮＳ５）区的反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）。借助脂质体将ＯＤＮ分别与所构建的载体一同转染人癌细胞系，短期培养后制备细胞提取液，以荧光发光法检测ｌｕｃ基因的表达．     

逆转录酶病毒载体介导的人EPO基因在PA317细胞中的表达

本研究首先将人ＥＰＯ基因构建到逆转灵酶病毒载体ＬＸＳＮ中，经ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将重组载体转染到包装细胞ＰＡ３１７中，转染的ＰＡ３１７细胞在含Ｇ４１８条件培养基中选择生长。通过ＤＮＡ－ＰＣＲ分析证明，重组逆转录酶病毒载体ＬＸＳＮ－ＥＰＯ基因整合到ＰＡ３１７细胞基因组ＤＮＡ中。ＲＴ－ＰＣＲ和细胞原位杂交分析表明，ＥＰＯ ｍＲＮＡ在ＰＡ３１７细胞中表达。转染ＰＡ３１７细胞培养上清体外ＥＰＯ生物活性     

血清学标志阴性的病毒性肝炎病原学研究

目的 了解血清学杜的病毒性肝炎病原学。方法 应用ＢＨＶ、ＨＣＶ、戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）和庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）核酸ＰＣＲ检测１０４例血清学标志阴性的病毒性肝炎病人,并用直接测序法对部分ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＥＶ ＲＮＡ逆转录ＰＣＲ产物进行了核苷酸序列测定。结果 １０４例血清学标志阴性的病毒性肝炎病人中,ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＥＶ ＲＮＡ和ＨＧＶ ＲＮＡ阳性率分别为２９．８％、３．８％、２２     

丙型肝炎病毒E1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的初步应用

目的在体外表达及纯化ＨＣＶ不同功能区的病毒蛋白，用于研究ＨＣＶ各功能区抗体的临床意义。方法将ＨＣＶＥ１，Ｅ２／ＮＳ１，ＮＳ５区的部分基因片段克隆到表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中ＭＢＰ编码基因的下游，在大肠杆菌中进行表达。结果表达的融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，ＭＢＰ－ＮＳ５的分子量分别为５７０００、６５０００、６２０００，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析表明这些融合蛋白具有ＨＣＶ的抗原活性。将这三种融合蛋白纯化后作为抗原检测了丙型肝炎患者血清９５份，其中抗－ＨＣＶＥ１阳性率为１０．５％，抗－ＨＣＶＥ２／ＮＳ１为６３．２％，抗－ＨＣＶＮＳ５为５３．７％。结论本实验表达的ＨＣＶ融合蛋白在ＨＣＶ感染的血清学诊断中具有一定的价值。     

丙型肝炎病毒核心基因在真核细胞中的表达

丙型肝炎病毒核心基因在真核细胞中的表达陈智，何南祥，刘克洲，章明太，陈明华，孙永良，姚航平９例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的慢性丙型肝炎患者血清，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增ＨＣＶ－Ｃ区片段基因。将ＨＣＶＤＮＡ插入质粒ｐＣＤＬ－ＳＲａ２９６，转染真...     

核酶细胞内抗丙型肝炎病毒作用的研究

目的 研究核酶抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的有效切割位点并获得高效、特异、无毒,价廉的ＨＣＶ特异性反式核酶。方法 根据文献报道的序列设计,合成ＨＣＶ５‘非结构（ＮＣ）区和核心（Ｃ）区的特异性反式核酶基因并分别克隆进入真核细胞表达载体ｐＳＶ２－ｇｐｔ．ＣＤ－ＳＲα中,转染ＨＣＶ感染的ＭＴ－２细胞,用定量逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,核酸杂交等方法测定核酶对ＨＣＶ的抑制作用。     

乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应

为了解ＨＢＶＸ基因表达产物对ＨＬＡ ＤＲ表达的效应 ,构建带Ｘ基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对ＨＬＡ ＤＲ表达的影响。用野生型ＨＢＶＸ基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 ｐＷＨＸⅡ转染ＨｅｐＧ2细胞。用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等分析鉴定目的基因ＤＮＡ片段与其在转染细胞中的表达产物ＨＢＶＸ蛋白。将带重组质粒 ｐＷＨＸⅡ的ＨｅｐＧ2细胞和带有ＨＢＶ全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…     

静脉毒瘾者84例HGV感染状况

目的调查庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）在静脉毒瘾者中的感染状况。方法采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测８４例静脉毒瘾者血浆标本。ＨＧＶＲＮＡ经热变性法提取后逆转录为ｃＤＮＡ，在ＨＧＶ５′非编码区（５′ＮＣＲ）设计两对引物进行巢式扩增，产物为２３８ｂｐ，并经限制性内切酶ＨｐａⅡ鉴定扩增产物来自ＨＧＶ。结果８４例中有１５例为ＨＧＶＲＮＡ阳性，阳性率为１７．９％。ＨＧＶＲＮＡ阳性病例中１１例合并丙型肝炎病毒感染（１１／１５）。结论静脉毒瘾者是ＨＧＶ感染的高危人群；不洁注射是获得ＨＧＶ感染的重要途径。     

丙型肝炎病毒E1,E2／NS1,NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的？…

目的 在体外表达及纯化ＨＣＶ不同功能区的病毒蛋白，用于研究ＨＣＶ各功能区抗体的临床意义。方法 将ＨＣＶ Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１，ＮＳ５区的部分基因片段克隆到表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲ１中ＭＢＰ编码基因的下游，在大肠杆菌中进行表达。     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

佛山市庚型肝炎病毒检测和部分基因序列分析

目的了解佛山庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染状况，分析ＨＧＶ非结构基因（ＮＳ）３区部分核苷酸序列。方法采用逆转录聚合酶链反应检测血清ＨＧＶＲＮＡ，对一例肝炎患者的ＨＧＶ（ＨＧＶＣ－ＦＳ）ＮＳ３区８１８ｂｐ片段作克隆及序列分析。结果８０例非甲－戊型肝炎患者和１０５例静脉吸毒者ＨＧＶＲＮＡ检出率分别为６．３％（５／８０）和２３．８％（２５／１０５），ＨＧＶＣ－ＦＳＮＳ３区片段核苷酸序列与ＨＧＶ－Ｕ４４４０２、Ｕ４５９６６、Ｕ３６３８０及ＨＧＶＣ９６４相同区段同源性为８５．５％、８５．６％、８８．０％、８９．２％。结论佛山存在ＨＧＶ感染，静脉吸毒者感染率较高，ＨＧＶ可能不是非甲－戊型肝炎主要致病因素。ＨＧＶＣ－ＦＳ与ＨＧＶＣ９６４同源性最高。