大鼠肺动脉平滑肌细胞钙池操纵的钙通道及其意义

【目的】通过对大鼠肺动脉平滑肌细胞钙库操纵性通道（SOC）的研究,阐述导致肺动脉平滑肌细胞内钙离子稳态失衡的信号途径,为治疗相关疾病提供新的思路。【方法】荧光探针Fura-2／AM标记细胞内Ca^2＋后。用荧光分光光度计检测EGTA耗竭胞内钙库后激活的SOC通道对急性酶分离的大鼠肺动脉平滑肌细胞（Ca^2＋）的影响。【结果】在无Ca^2＋缓冲液中,大鼠肺动脉平滑肌细胞静息Ca^2＋为（72．48±3．12）nmol／L,向细胞悬液中分别引入两种浓度的Ca^2＋（终浓度分别为1．5;3．0nmol／L）,此时静息Ca^2＋为（121．56±6．45）,（187．97±2．98）nmol／L,而预先用EAGA10mmol／L处理的大鼠肺动脉平滑肌细胞Ca^＋显著提高。上述升高效应对Verapamil（5μmol／L）不敏感,但可被2APB（20～100μmol／L）抑制。且抑制率随2-APB浓度的提高而增加。【结论】通过对急性酶分离的大鼠单个肺动脉平滑肌细胞上胞内钙库耗竭激活的SOC通道的研究,对于进一步深入研究钙通道活性改变在肺血管收缩（HPV）反应中所起的作用具有重要意义。     

巢蛋白在低氧大鼠肺组织及肺动脉平滑肌细胞的表达及意义

目的研究不同间期低氧大鼠肺组织及低氧培养的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中巢蛋白的表达变化。方法24只雄性sD大鼠随机分为正常对照组（N组）,低氧2周组（H2W组）,低氧4周组（H4w组）。测定大鼠肺动脉平均压（mPAP）、颈动脉平均压（mCAP）、右心室／（左心室＋室间隔）质量比[RV/（LV＋S）]、肺动脉相对中膜厚度（PAMT）;免疫组织化学染色测定肺动脉巢蛋白含量。分别采用逆转录PCR和蛋白印迹法检测各组大鼠肺组织巢蛋白的mRNA及蛋白含量。蛋白印迹法检测常氧和缺氧培养的PASMC中巢蛋白的蛋白含量。结果H2W组、H4w组mPAP、RV／（LV＋S）、PAMT、肺动脉巢蛋白的蛋白含量、肺组织匀浆巢蛋白mRNA及蛋白含量均显著高于N组（P〈0．01）,且随着低氧时间的延长,逐渐增加;肺动脉平滑肌细胞中的巢蛋白的蛋白含量,随着低氧培养的时间的增加而逐渐增高（P均〈0．05）。结论低氧时巢蛋白在大鼠肺组织及肺动脉平滑肌细胞中的表达增加,后者可能在肺血管重构中起着重要作用。     

钙调蛋白在介导大鼠结肠平滑肌细胞Ca^2＋内流的作用机制

【目的】探讨钙调蛋白在介导大鼠结肠平滑肌细胞中Ca^2＋内流的作用机制。【方法】将酶解分离好的大鼠结肠平滑肌细胞,随机分为以下4组：①对照组;②EGTA组;③EGTA＋Veraparmil组;④EGTA＋W7组。荧光探针Fura-2／AM标记细胞内游离Ca^2＋,荧光分光光度计检测大鼠结肠平滑肌细胞Ca^2＋浓度。【结果】在无Ca^2＋缓冲液中加入EGTA（1mmol／L）使Ca^2＋浓度由静息时（82．24±3．65）nmol／L升高至（267．45±4．86）nmol／L,继之,向细胞外液中引入两种浓度的Ca^2＋（1．5mmol／L和3．0mmol／L）,导致Ca^2＋浓度进一步升高,分别为（470．23±4．21）hmol／L、（945．32±3．56）nmol／L．上述升高效应对L型电压操纵性钙通道阻滞剂维拉帕米（verapamil,5μmol／L）不敏感（P〉0．05）,但钙调蛋白抑制剂W7对上述升高效应有抑制作用（P〈0．01）。【结论】钙调蛋白参与大鼠结肠平滑肌细胞的钙内流。钙调蛋白抑制剂W7能抑制由EGTA引起的细胞钙内流。这对于进一步深入研究钙通道活性改变,为预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化管疾病具有重要意义。     

低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞中Kv2．1基因表达的变化

目的：探讨肺动脉平滑肌细胞门控钾离子通道Kv2.1基因在缺氧性肺动脉高压发病中的作用.方法：①实验于2003-04/2004-06在武汉大学人民医院胸心血管外科实验室完成.选用健康成年雄性普通级Wistar大鼠48只.随机将大鼠分为6组,分别为对照组、缺氧8 h组及缺氧3,7,14和28 d组,每组8只.将动物置于常压低氧仓,仓内注入流通氮氧混合气,调节仓内氧浓度保持在（10&;#177;5）%,将大鼠造成常压缺氧性肺动脉高压模型.对照组：不造成缺氧性肺动脉高压大鼠模型.缺氧8 h组及缺氧3,7,14和28 d组：分别将大鼠置于缺氧环境中8 h,3,7,14和28 d.②记录肺动脉压力波,计算肺动脉平均压.测定血浆中游离钾、钙离子浓度.应用全自动图像心肺血管分析软件测定肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度及肺细小动脉中膜厚度.③对肺动脉平滑肌细胞进行染色及显色后,镜下观察肺动脉平滑肌细胞表面核抗原以及bcl-2抑凋亡因子表达.bcl-2抑凋亡因子表达：0为不表达,＋为微弱表达,（）为中等阳性,（）为强阳性.④以图像分析系统（IBAS）对杂交点进行密度扫描,以经同样处理的β-actin基因mRNA表达量作为内参照,肺动脉平滑肌细胞Kv2.1基因mRNA表达以两者的积分吸光度（A值）的比值表示.⑤对数据进行方差分析处理,组间比较采用t检验.结果：大鼠48只均进入结果分析.①随着缺氧时间延长,大鼠平均肺动脉压、肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度及肺细小动脉中膜厚度逐渐升高.各缺氧组大鼠平均肺动脉压明显高于对照组（P＜0.01）,缺氧3,7,14,28d组大鼠肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度及肺细小动脉中膜厚度明显高于对照组（P＜0.05～0.01）.②随着缺氧时间延长,大鼠血浆中游离K＋浓度逐渐降低、Ca2＋浓度逐渐升高.缺氧3,7,14,28 d组大鼠血浆中游离K＋浓度明显低于对照组（P＜0.05～0.01）,缺氧7,14,28 d组大鼠血浆中游离Ca2＋浓度明显高于对照组（P＜0.05～0.01）.③随着缺氧时间延长,大鼠平滑肌细胞中增殖细胞核抗原阳性表达及bcl-2表达逐渐上升和增强.缺氧3,7,28 d组大鼠平滑肌细胞中增殖细胞核抗原阳性表达明显高于对照组（P＜0.05～0.01）.④随缺氧时间的延长,Kv2.1基因mRNA转录水平呈下降趋势,与内参照β-action基因mRNA的A值比值分别为0.94,0.90,0.64,0.36,0.26.结论：①Kv2.1基因在正常大鼠肺动脉平滑肌细胞上表达正常,而在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞上的表达则降低.②钾离子通道活性降低抑制细胞凋亡,并增加细胞中的钙离子浓度,从而导致血管重建,产生肺动脉高压.     

线粒体内膜KATP通道开放剂合用Na＋／Ca2＋交换阻滞剂对离体大鼠心肌梗死面积的影响

【目的】探讨线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP通道）开放剂尼可地尔合用Na＋／Ca2＋交换阻滞剂K昏R7943对离体大鼠心肌梗死面积的影响。【方法】离体大鼠心脏应用改良的Langendorff装置灌流,行45min缺血（即将左、右冠脉灌流量减到原灌流量的5Voo）及2h再灌注。Wistar大鼠40只,随机分为4组：对照组、尼可地尔组、K＆R7943组、尼可地尔合用K昏R7943组（合用药物组）。观察各组冠脉灌流液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的变化,心肌梗死面积的区别。【结果】对照组心肌梗死范围为34．31％,尼可地尔组为26．35％,KBR7943组为28．74％,两者合用时心肌梗死范围为19．23％,合用组显著低于其他三组（P〈0．01）。合用药物组SOD活性显著高于其它三组,MDA显著低于其他三组（P〈0．01）。【结论】尼可地尔合用KBR7943能明显减少心肌梗死面积,能提高冠脉灌流液中SOD活性,减少MDA含量。     

肿瘤坏死因子-α对脊髓保护功能的电生理机制研究

目的:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有脊髓保护功能,脊髓损伤后神经元Ca2+通道开放加重钙超载导致细胞损伤,而TNF-α与Ca2+通道之间的直接关系尚未明确,为此研究TNF-α对大鼠脊髓背根神经节(DRG)感觉神经元细胞膜电压门控Ca2+通道的电生理功能。方法:实验于2003-09/2004-01在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。实验采用酶解获得单个DRG细胞,采用标准全细胞膜片钳技术记录单一细胞分别在无药物干预和TNF-α10ng/L与1μg/L条件下,依次给予单刺激,连续刺激和相关的双刺激时电压门控Ca2+电流(ICa-L),并分析对比电流形态、幅度、电流-电压曲线、最大电流的激活电压、反转电位和稳态灭活曲线形状的变化。结果:与用药前比较,TNF-α10ng/L和1μg/L可显著性抑制ICa-L(P<0.01),且两浓度间差异有显著性意义(P<0.01);但TNF-α对ICa-L电流-电压(I-V)曲线的形状、峰电流对应的电位和反转电位无明显影响,加速稳态灭活过程。结论:TNF-α抑制ICa-L,可能是机体通过TNF-α对损伤脊髓发挥保护功能的机制之一。     

槲皮素对肺动脉平滑肌细胞增殖及大鼠低氧性肺动脉高压的影响

目的研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）对血小板衍生生长因子ＰＤＧＦ诱导的平滑肌细胞增殖及低氧性肺动脉高压的影响。方法①用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞,采用ＭＴＴ比色法、流式细胞及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ技术对ＰＤＧＦ诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响进行分析;②通过大鼠缺氧动物模型观察槲皮素对右心室收缩压（ＲＶＳＰ）,右心室／左心室＋室间隔比值（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）及肺小动脉图像分析的影响。结果与对照组相比槲皮素处理组能显著地抑制ＰＤＧＦ诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,明显地抑制ＰＤＧＦ诱导的肺动脉平滑肌细胞酪氨酸磷酸化程度,且呈明显剂量依赖性,槲皮素对ＲＶＳＰ、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ及肺小动脉中膜肥厚也有明显的抑制作用。结论槲皮素可显著地抑制ＰＤＧＦ诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,对低氧性肺动脉高压有一定的防治作用。     

血红蛋白类携氧载体对大鼠肺动脉平滑肌细胞大电导钙离子激活钾离子通道电流的影响

目的 评价不同剂量血红蛋白类携氧载体（HBOC）对大鼠肺动脉平滑肌细胞大电导钙离子激活钾离子通道（BKCa）电流的影响.方法 采用二步酶消化法急性分离Sprague Dawley（SD）大鼠肺动脉平滑肌细胞.BKCa电流采用四氨基吡啶（4-AP）进行分离并使用全细胞电压钳记录.选取急性分离后状态良好的大鼠肺动脉平滑肌细胞30个,根据计算机生成的随机数将其分为5组,每组6个平滑肌细胞,分别给予血红蛋白含量（kg/L）为0.25×10^-2,0.50×10^-2,1.00×10^-2,2.00×10^-2,3.00×10^-2的HBOC处理.观察不同剂量HBOC对BKCa电流的影响,并与给予HBOC前的BKCa电流相比较（实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准）.结果 经血红蛋白含量为0.25×10-2 kg/L的HBOC处理后,BKCa电流轻度增加,BKCa电流值与基础值比较,增加3.90％;分别给予血红蛋白含量（kg/L）为0.50×10^-2,1.00×10^-2,2.00×10^-2,3.00×10^-2的HBOC处理后,BKCa电流呈不同程度下降,BKCa电流值与基础值比较,分别下降8-04％,28.61％,46.53％和65.97％,HBOC对BKCa电流的抑制作用呈剂量依赖性（b=0.931 6,P=0.007）.结论 HBOC呈剂量依赖性抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞BKCa电流.BKCa电流的下降可能是HBOC导致血管收缩的原因.     

维拉帕米对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的保护作用

【目的】探讨钙通道阻滞剂维拉帕米对重症急性胰腺炎（severacutepancreatitis,SAP）大鼠肺损伤的影响。【方法]wistar大鼠45只,随机分为假手术组（A组）、SAP纽（B组）和维拉帕米治疗组（C组）。观察动物血清中白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（turnernecrosisfactor-α,TNF-α）的含量,肺组织病理学变化。【结果】SAP时,大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量均显著升高（P〈0．01）,肺损伤严重。维拉帕米治疗纽炎性细胞因子水平显著下降（P〈0．05）,肺病理损害程度显著减轻（P〈0．05）。【结论】维拉帕米可抑制SAP大鼠炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的产生和释放,减轻肺损伤的程度。     

低氧大鼠肺内结缔组织生长因子表达与肺血管重建的关系

目的了解低氧肺动脉高压时肺内结缔组织生长因子（CTGF）与肺血管重建的关系。方法将20只雄性Wistar大鼠分为低氧性肺动脉高压组（n=10）和对照组（n=10）两组,肺动脉高压组以常压低氧建立大鼠肺动脉高压模型,以微导管法测定各组大鼠肺动脉压,采用免疫组化法检测各组大鼠肺内CTGF和Ⅰ型胶原的表达,对肺组织切片进行图象分析。结果低氧3周后,低氧组大鼠形成明显的肺动脉高压,管壁增厚和管腔狭窄,低氧组大鼠肺动脉压（2.89±0.41）kP,右心室肥厚指数[RV/（LV＋S）]为41.01±2.79、管壁厚度占外径的百分比（WT%）为35.13±10.31,管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）为54.18±11.46,分别与正常对照组（1.37±0.26）kP、24.59±3.51、23.66±9.74和40.59±13.87相比明显升高（P〈0.01）;肺小动脉CTGF免疫阳性染色在低氧组大鼠为1.32±0.05,与正常对照组1.10±0.04相比明显增强（P〈0.01）,低氧组大鼠Ⅰ型胶原免疫阳性染色为1.30±0.04,与正常对照组1.14±0.05相比明显增强（P〈0.01）。结论低氧所致CTGF的合成增多在低氧性肺血管重建和肺动脉高压的发病过程中起一定的作用。     

布地奈德对沙丁胺醇抑制平滑肌内游离钙浓度升高快速影响

目的观察布地奈德(Budesonide,BUD)对沙丁胺醇(Albuterol,ALB)抑制气道平滑肌细胞内游离钙(Ca2+[i])浓度升高的快速影响作用。方法取原代培养豚鼠气道平滑肌细胞,通过共聚焦显微镜下荧光强度检测,比较不同浓度BUD(1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L)与ALB联合作用10 min ALB抑制胞内Ca2+[i]释放和胞外Ca2+内流作用的快速影响,同时应用米非司酮(Mifepristone,RU486)及放线菌酮(Cycloheximide,CHX)作为阻断剂进行实验,排除上述反应中的基因组效应。结果组胺引起胞内Ca2+[i]释放实验中,阳性对照组、ALB对照组、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L及1×10-8mol/L BUD联合ALB组荧光强度峰值分别为89.6±27.1、63.6±23.4、44.3±18.0、51.9±22.8及59.2±22.8;外源性Ca2+内流实验中,阳性对照组、ALB对照组、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L及1×10-8mol/L BUD联合ALB组荧光强度峰值分别为77.3±23.1、56.4±18.7、40.1±14.9、47.0±20.8和53.7±23.5。此两组实验中,1×10-6mol/L和1×10-7mol/L BUD联合ALB组Ca2+[i]荧光强度峰值与ALB对照组比较差异具有统计学意义(P0.01或P0.05)。而在胞内Ca2+[i]释放及外源性Ca2+内流实验条件下,RU486组及CHX组Ca2+[i]荧光强度峰值与1×10-6mol/L BUD联合ALB组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论哮喘急性发作时,联合应用BUD能够增强ALB减轻细胞收缩强度的作用,快速改善气道痉挛症状,且此作用不能被糖皮质激素受体拮抗剂和蛋白合成抑制剂所阻断。     

Physiology in medicine: importance of hypoxic pulmonary vasoconstriction in maintaining arterial oxygenation during acute respiratory failure

Hypoxic pulmonary vasoconstriction continues to attract interest more than half a century after its original report because of persistent mystery about its biochemical mechanism and its exact physiological function. Recent work suggests an important role for pulmonary arteriolar smooth muscle cell oxygen-sensitive voltage-dependent potassium channels. Inhibition of these channels by decreased PO2 inhibits outward potassium current, causing membrane depolarization, and calcium entry through voltage-dependent calcium channels. Endothelium-derived vasoconstricting and vasodilating mediators modulate this intrinsic smooth muscle cell reactivity to hypoxia. However, refined modeling of hypoxic pulmonary vasoconstriction operating as a feedback mechanism in inhomogeneous lungs, using more realistic stimulus-response curves and confronted with direct measurements of regional blood flow distribution, shows a more effective than previously assessed ability of this remarkable intrapulmonary reflex to improve gas exchange and arterial oxygenation. Further studies could show clinical benefit of pharmacological manipulation of hypoxic pulmonary vasoconstriction, in circumstances of life-threatening hypoxemia.     

Alternation of regulation system for pulmonary arterial tone in pulmonary hypertension]

In pulmonary artery smooth muscle cells(PASMC), the Ca-influx required for myogenic tone is mainly supplied through the L-type Ca channels, which sustained open around resting membrane potential. Therefore, the voltage-gated K channels, which determine membrane potential in PASMC, are critical for regulation of the Ca-influx and myogenic tone. The voltage-gated K channels are inhibited in hypoxic condition. The inhibition may be related to the hypoxic pulmonary vasoconstriction and the chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension. In subjects with primary pulmonary hypertension, the voltage-gated K channels are also inhibited. On the other hand, the Ca-activated K channels of PASMC are also inhibited in chronic exposure with pulmonary hypertension. The reduction of the K channels in pulmonary hypertension may enhance proliferation of PASMC.     

Physiology in medicine: importance of hypoxic pulmonary vasoconstriction in maintaining arterial oxygenation during acute respiratory failure

Hypoxic pulmonary vasoconstriction continues to attract interest more than half a century after its original report because of persistent mystery about its biochemical mechanism and its exact physiological function. Recent work suggests an important role for pulmonary arteriolar smooth muscle cell oxygen-sensitive voltage-dependent potassium channels. Inhibition of these channels by decreased PO₂ inhibits outward potassium current, causing membrane depolarization, and calcium entry through voltage-dependent calcium channels. Endothelium-derived vasoconstricting and vasodilating mediators modulate this intrinsic smooth muscle cell reactivity to hypoxia. However, refined modeling of hypoxic pulmonary vasoconstriction operating as a feedback mechanism in inhomogeneous lungs, using more realistic stimulus-response curves and confronted with direct measurements of regional blood flow distribution, shows a more effective than previously assessed ability of this remarkable intrapulmonary reflex to improve gas exchange and arterial oxygenation. Further studies could show clinical benefit of pharmacological manipulation of hypoxic pulmonary vasoconstriction, in circumstances of life-threatening hypoxemia.     

Enhancement of the pulmonary vasoconstriction reaction to alveolar hypoxia in systemic high blood pressure

1. In systemic hypertension the pulmonary vessels show an excessive tone at rest and hyper-react to adrenoceptor stimulation. Alterations in Ca2+ handling by the vascular smooth muscle cells seem to underlie these disorders. Alveolar hypoxia also constricts pulmonary arteries, increasing the intracellular Ca2+ availability for smooth muscle contraction. This suggests the hypothesis that hypoxic pulmonary vasoconstriction depends on similar biochemical disorders, and that the response to the hypoxic stimulus may be emphasized in high blood pressure. 2. In 21 hypertensive and 10 normotensive men, pulmonary arterial pressure and arteriolar resistance have been evaluated during air respiration and after 15 min of breathing 17, 15 and 12% oxygen in nitrogen. Curves relating changes in pulmonary arterial pressure and arteriolar resistance to the oxygen content of inspired gas had a similar configuration in the two populations, but in hypertension were steeper and significantly shifted to the left of those in normotension, reflecting a lower threshold and an enhanced vasoconstrictor reactivity. 3. This pattern was not related to differences in severity of the hypoxic stimulus, degree of hypocapnia and respiratory alkalosis induced by hypoxia, and plasma catecholamines. 4. The association of high blood pressure with enhanced pulmonary vasoreactivity to alveolar hypoxia could have clinical implications in patients who are chronically hypoxic and have systemic hypertension.     

低氧肺动脉高压大鼠对红细胞增多的适应

目的：研究低氧性肺动脉高压大鼠对实验性红细胞增多的适应。方法：健康SD大鼠28只,体重200～250g,随机分为4组：常氧对照组（N）、单纯低氧组（H）、低氧＋低剂量人重组促红细胞生成素（rEPO）600u／kg（H＋E1）组、低氧＋高剂量rEPO 1200u／kg（H＋E2）组,每组7只大鼠。除常氧对照组外各低氧组大鼠均缺氧21d,每日8h。其中后两组每周腹部皮下注射不同剂量的rEPO三次。取血样测定红细胞数、全血粘度及红细胞变形指数;颈外静脉插管测定平均肺动脉压力;光镜观察反映肺动脉重构程度的形态学参数肺小动脉管壁厚度百分比、肺非肌性小动脉肌化程度。结果：①随着rEPO注射剂量的增加,红细胞、全血粘度有不同程度的增高;②全血粘度增高的同时红细胞变形指数也相应地增加;③随着rEPO剂量的增加,平均肺动脉压力逐渐增高,但是肺血管重构程度反而有所缓解。结论：实验性红细胞增多通过改变红细胞变形性和缓解肺血管重构程度来阻遏低氧性肺动脉高压的进一步发展。     

缺氧对肾癌细胞STC1、HIF-1α及线粒体膜电势稳定影响的研究

目的检测缺氧条件下肾癌细胞斯钙素蛋白l（STCl）及线粒体膜电势稳定指标的变化,结合细胞增殖和Ca2＋水平,初步探讨肾癌细胞可能的抗乏氧机制。方法分别使用50μmol／L、100μmol／L、150μmol／L的CoCl2干预细胞培养基构建化学性缺氧模型;MTT法检测细胞生长情况,荧光分光光度法检测细胞内Ca2＋水平和线粒体膜电位（△ψm）,紫外分光光度计测MPTP,RT-PCR检测STCl、HIF-1α的基因表达情况。结果与对照组相比,缺氧能显著抑制细胞增殖,促进细胞内Ca2＋水平上升（P〈0．05）;缺阜可使MPTP开放度增加、△ψm减低（P〈0．05）,且此时细包内STCl、HIF-1α的基因表这脯（P〈0．05）;以上变化均随着缺氧程度的加剧而逐渐增大。结论缺氧条件下STCl、HIF-1α对Ca2＋的负调控可能有利于肾癌细胞线粒体膜电势稳定,对肾癌细胞起保护作用。