携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制

我们以体外能够表达野生ＨＢＶ的质粒ｐＨＢＶ30 91为研究对象 ,用ＧＦＰ基因替代ＨＢＶ的Ｓ读码框构建携带外源基因的重组ＨＢＶ载体ｐＨＢＶ Ｓ ＧＦＰ。为了保证重组载体中外源基因能够有效表达及整个ＨＢＶ基因读码框的顺利通读 ,在改造ＨＢＶ时保留了Ｓ基因的前 9个核苷酸使ＧＦＰ与之融合 ,从而保证Ｓ基因起始密码子附近的ＤＮＡ结构尽可能与野生ＨＢＶ一致 ,保持ＨＢＶ自身基因表达调控元件的特性。结果表明 :(1)将构建的重组ＨＢＶ基金项目 :国家自然科学基金资助项目( 30 170 85 4) ;全军医药卫生科研基金资助项目( 0 1ＭＡ0 10 )…     

DPC4基因转染结肠癌细胞对VEGF表达的影响

目的研究DPC4基因转染人结肠癌细胞株SW620对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法利用DNA的限制性内切酶双酶切技术鉴定重组质粒PCDNA3.1-DPC4;利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达Smad4蛋白的DPC+4-SW620(PCDNA3.1-DPC4转染的SW620高转移性结肠癌细胞株)细胞模型;采用Western blot检测细胞中Smad4的表达;采用ELISA检测细胞上清液中VEGF的蛋白表达量;采用半定量逆转录多聚酶链反应RT-PCR技术检测细胞中VEGF的mRNA表达量.结果阳性质粒组DPC+4-SW620细胞的Smad4蛋白表达强于空白质粒组PCDNA3.1-SW620和未转染组SW620;DPC+4-SW620组细胞上清液VEGF蛋白分泌明显减少,与PCDNA3.1-SW620组和SW620组比较差异有显著性(P＜0.05),DPC+4-SW620组细胞与PCDNA3.1-SW620组细胞中VEGF mRNA半定量结果和SW620组比较,其表达量分别下降28.3%和4.5%.结论 DPC4可抑制人结肠癌细胞株SW620中VEGF的表达.     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

重组人beta防御素基因在COS-7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性，本研究构建真核重组表达载体pCMv．tag2B／hBD-2以进行COS-7细胞转染表达实验。将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMA．tag2B构建出hBD-2的重组表达裁体pCMV．tag2B／hBD-2，并经DNA顺序证明hBD-2eDNA片段的插入方向和其全长cDNA的硷基组成顺序均准确无误。     

乙型肝炎病毒感染基因转染模型研究进展

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所引起的严重危害我军广大官兵健康的主要传染病之一,严重影响着部队的有生力量,而HBV 感染也是导致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因.据总后卫生部信息中心全军医疗信息管理系统2000年部队所有驻军以上医院住院病例病案数据库首页显示,乙肝在部队的经济负担排名中位列首位,有必要采取有效措施减少乙肝的发病.因此,攻克乙型病毒性肝炎一直作为军队九五、十五、十一五计划的重点科研攻关项目.     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

基因转染技术在肾脏病研究中的应用

基因转染技术在肾脏病机理研究及其防治中的应用已受到关注,并提出了针对肾小球、肾小管和肾间质的各种基因转染方法.成功地应用病毒载体和非病毒载体进行直接体内基因转染,并通过系膜细胞载体和小管上皮细胞载体系统进行间接体内基因转染,并获得较好效果,为研究肾脏病的发病机理和治疗方法奠定了基础.     

HC基因在动物细胞中的复制表达研究

ＨＣＶ研究的深入迫切需要建立ＨＣＶ的细胞模型，本文就ＨＣＶ直接感染和ＨＣＶ全长和部分基因ｃＤＮＡ转染的细胞模型研究，以及利用近些模型对ＨＣＶ和ＨＣＶ与宿主相互关系的研究进行了综述．     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘髓核细胞的表达

目的　观察以腺病毒为载体的外源性治疗基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后的表达。　方法　采用本实验室构建的腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β12 0 μl(6× 10 6 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内 ;手术后不同时间分别取出椎间盘 ,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物测定 ;用VIDAS图像分析系统进行半定量观察。　结果　免疫组织化学染色显示注射Ad CMV hTGF β1椎间盘 ,4d组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒 ;1周组即显示强阳性染色 ,阳性表达持续至 12周组。实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或弱阳性反应。　结论　椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源性基因转染 ;腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后能在相当长时间内表达TGF β1蛋白     

神经肽Y基因在COS－7细胞中的表达

构建大鼠ＮＰＹ基因的瞬时表达载体ｐＳＶＬ－ＮＰＹ，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ~（ＴＭ）介导将其导入ＣＯＳ－７细胞中，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和ＨＰＬＣ检测结果显示：ｐＳＶＬ－ＮＰＹ质粒转染的ＣＯＳ－７细胞可表达ＮＰＹｍＲＮＡ及成熟肽ＮＰＹ。     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

GFP mRNA在树突状细胞中的转染及其影响因素分析

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时,从人的外周血液中分离单核细胞,并在体外经GM-CSF和IL-4刺激分化为DC。通过转染试剂介导将合成的GFPmRNA转染到DC内并使其表达。采用流式细胞术检测其转染效率和表达水平。结果:体外合成GFPmRNA,经转染试剂介导,实现了gfp基因在DC中的表达。不同的转染试剂、mRNA用量和细胞密度对mRNA的转染效率有较大的影响。采用Transmes-sengerTransfectionKit转染试剂,1μgGFPmRNA在200μLX-VIVO-15无血清培养基中的转染密度为2.5×109/L的DC,可获得较好的转染效果(转染效率达27%以上)。结论:在适当的条件下,通过mRNA转染DC可获得较高的转染效率。     

DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。     

用免疫组化方法鉴定转染基因nm-23-H1蛋白表达的实验体会

作者通过转染细胞(ACC-m／nm23-H1)蛋白表达经免疫组化方法分析鉴定获得满意效果这一方法．将该法与蛋白印迹方法加以比较，并进行分析评价，重新认识到该法具有许多优势。     

转染双启动子杆状病毒表达载体在昆虫细胞共表 …

目的 通过体外表达ｒｈＩＬ－１２,以供研究其在体内外的生物学效应。方法 外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）、粘时细胞和人口腔表皮样癌细胞ＫＢ分别经ＳＡＣ（含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌ＣｏｗａｎⅠ菌株）、ＩＦＮ－γ＋ＬＰＳ和ＰＤＢｕ（１２、１３－二丁酸佛波酯）刺激,以ＧＩＴ（异硫氰酸胍）一步法提取细胞总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得ＩＬ－１２ Ｐ４０和Ｐ３５ ｃＤＮＡ,将两条基因分别插入双启动子杆状病毒转染载