乙型肝炎病毒在丁型肝炎病毒包装中的作用机理研究

用含ＨＢＶ全基因和ＨＢＶ大、中、小分子表面蛋白基因的真核细胞表达质粒（ＣＭＶ－ＨＢＶ、ＣＭＶ－ＬＳ、ＣＭＶ－ＭＳ、ＣＭＶ－Ｓ）分别与含ＨＤＶ ｃＤＮＡ三聚体的重组质粒共转染ＣＨＯ细胞。转染后３天在上述４种转染细胞内及培养上清中均检出了ＨＤＶ ＲＮＡ和ＨＤＡｇ表明上述４种转染细胞的培养上清中均有ＨＤＶ病毒颗粒的包装和分泌。提示：ＨＤＶ病毒的包装可能仅需ＨＢＶ Ｓ 基因及其小分子表面蛋白的辅助。     

1,25(OH)2D3及其类似物对人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖分化调节作用的分子机制

目的 :研究维生素Ｄ3受体 (ＶＤＲ)及其靶基因ｐ2 1在 1 ,2 5(ＯＨ) 2 Ｄ3及其类似物调节人骨肉瘤细胞系ＨＯＳ - 860 3增殖分化中的作用。方法 :构建ＶＤＲ反义ｃＤＮＡ的真核表达载体 ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法转染人骨肉瘤细胞系ＨＯＳ - 860 3,经Ｇ41 8筛选后获得稳定转染的单克隆细胞株 (ＶＤＲａｓｌ～ 6) ,并采用免疫组化方法和瞬时转染报告基因技术分别检测ＶＤＲａｓ3细胞内源性ＶＤＲ蛋白的表达情况和转录激活功能 ;继而利用ＶＤＲａｓ3细胞研究ＶＤＲ被阻断后细胞增殖以及靶基因ｐ2 1ｍＲＮＡ表达的变化。用定量ＲＴ -Ｐ…     

丙型肝炎病毒感染HepG2细胞模型的初探

自从1989年丙肝病毒(ＨＣＶ)ｃＤＮＡ被克隆以来,在建立敏感、稳定的ＨＣＶ感染细胞模型方面亦作了大量的工作,但目前仍缺乏自然感染状态的小动物模型及稳定的ＨＣＶ感染的细胞株,我们采用ＨＣＶ阳性血清连续感染法感染ＨｅｐＧ2细胞,试图建立稳定的ＨＣＶ复制细胞系。感染血清来自一位慢性丙肝患者,抗ＨＣＶ及ＨＣＶＲＮＡ均阳性,抗ＨＡＶ、抗ＨＤＶ、ＨＤＡｇ、乙肝全套、抗ＨＥＶ检测均为阴性。靶细胞ＨｅｐＧ2购自湖南医科大学细胞培养中心。将05ｍｌＨＣＶＲＮＡ阳性血清与5ｍｌＲＰＭＩ1640完全培养基加入刚传代的ＨｅｐＧ2细胞培养瓶…     

pLTRNL介导HSV—1 TK基因长期稳定转染人肝癌细胞系的建立

以脂质体基因转移技术，将含ＨＳＶ－１ＴＫ基因的重组逆转录病毒载体ｐＬＴＲＮＬ转染人肝癌细胞系ｈＨＣＣ，经抗生素Ｇ４１８选择，筛选出ＨＳＶ－１ＴＫ基因转染的ｈＨＣＣ再进行克隆化和亚克隆化后扩大培养，应用ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ及ｓｌｏｔ－ｂｌｏｔ狭槽印迹等方法。对转染细胞基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ进行了鉴定。结果表明，ＨＳＶ－１ＴＫ基因已整合入ｈＨＣＣ细胞基因组中，且有ＴＫ基因的ｍＲＮＡ转录。ＨＳＶ－１ＴＫ基     

地高辛标记探针原位杂交检测肝内HDV RNA

本研究采用随机引物法用地高辛标记ＨＤＶ　ｃＤＮＡ全基因片段作为探针，通过原位杂交方法检测了５８例慢性乙型肝炎患者的肝组织石蜡切片中的ＨＤＶ　ＲＮＡ，发现ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性者９例，检出率为１５．５％。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性物质在肝细胞内的分布方式有胞浆型、核膜型、核仁型、核膜核仁型和全核型等。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性肝细胞在显微镜下多数正常或只显示轻微病变。本文结果提示ＨＤＶ的致病性并非由于ＨＤＶ的直接细胞毒作用，而是宿主细胞和病毒共同作用结果，但其确切生物学意义还有待进一步探索。     

斑点杂交及RNA酶保护分析法检测反义HSP90基因转染细胞 …

目的：检测ＨＳＰ９０反义核酸转染细胞后反义ＲＮＡ的表达,方法：采用打点杂交及ＲＮＡ酶保护分析法,结果：ＨＳＰ９０反义核酸转染细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９有ＨＳＰ９０反义ＲＮＡ的表达。结论：ＥＳＰ９０反义ＲＮＡ在ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９细胞的表达,为进一步研究ＨＳＯ９０     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的 非定标性突变的发生率

目的 :ＲＥＶ3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的ＤＮＡ聚合酶 ,参与真菌易误性复制后修复通路。本研究采用反义核酸技术建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断的人胚肾细胞系 ,研究它与非定标突变形成的关系。方法 :1 ｈＲＥＶ3基因片段从ｐＢＳ -ｈＲＥＶ3反向重组入载体ｐＭＡＭｎｅｏ -ａｍｐ 构建真核反义诱导表达质粒。 2 重组质粒转染ＨＥＫ2 93细胞 ,Ｇ41 8全培养基筛选建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断细胞系。 3 细胞系生长速率及ＭＮＮＧ敏感性检测 :以ｈＲＥＶ3基因表达反义阻断细胞系为实验组 ,转染有空载体的细胞系以及母本细胞系为对…     

重组腺病毒介导的野生型p53对人胰腺癌细胞凋亡的诱导作用

目的研究恢复外源性野生型（ｗｔｐ）ｐ５３的表达对人胰腺癌细胞生长和凋亡的作用。方法构建了一个复制缺陷型５型腺病毒ｗｔｐ５３表达载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，含有人ＣＭＶ启动子，人野生型ｐ５３和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号，经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染胰腺癌ＰＣ２细胞。ＰＣＲ和免疫沉淀技术证实转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的存在和表达。结果转染的ＰＣ２细胞的生长率和３Ｈ掺入率降低。原位凋亡检测、流式细胞术和ＤＮＡ凝胶电泳显示转染细胞凋亡明显增多。而ＰＣ２细胞和用Ａｄ５ｐＸＪ转染的细胞没有这些改变。结论复制缺陷型腺病毒是一种安全高效的基因转移载体，恢复ｗｔｐ５３的表达可以有效地诱导凋亡和抑制胰腺癌细胞生长     

丁型肝炎病人肝组织HDVRNA与 HBVDNA的表达及关系

目的 探讨丁型肝炎病人肝组织中ＨＤＡｇ、ＨＤＶＲＮＡ与ＨＢＶＤＮＡＧ表达及关系。方法 应用免疫组化和原位杂交技术检测了７９全丁型肝炎病人肝组织ＨＤＡｇ、ＨＤＶＲＡＮ～ＨＢＶＤＮＡ表达,以５２例型肝炎病人肝组织作对照。结果 丁型肝炎ＨＢＶＤＮＡ检出率（２７％）低于乙型肝炎（４４％）（Ｐ〈０．０５）。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的ＨＤＶＲＮＡ蓄积或ＨＤＡｇ呈强型强表达,ＨＤＶＲＮＡ表达     

检测丁型肝炎病毒RNA打点杂交法的建立及其应用

经缺口平移法以ａ－３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记１．０ｋｂ的丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ｃＤＮＡ片段为探针，采用蛋白酶Ｋ直接从血清中提取ＨＤＶＲＮＡ，建立了检测血清中ＨＤＶＲＮＡ的打点杂交法，其灵敏性可达１ｐｇ水平，与乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ无交叉杂交反应；并应用于检测我国５９４９份ＨＢｓＡｇ阳性血清中的ＨＤＶＲＮＡ，共检出１７６份ＨＤＶＲＮＡ阳性，检出率为２．９５％。     

鸭乙型肝炎病毒DNA体内转染的研究

利用两种鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ双体质粒及环化的ＤＨＢＶＤＮＡ体内转染２ｄ龄鸭及４～２０ｄ龄鸭，大多数鸭产生了短暂病毒血症，少数鸭产持续病毒血症，转染鸭血清中检测得ＤＨＢｓ／ｐｒｅＳＡｇ，ＤＨＢＶＤＮＡ及ＤＨＢＶ病毒颗粒，转染鸭血清腹腔注射１ｄ龄鸭可感染成功，转染鸭肝组织检测到复制型ＤＨＢＶＤＮＡ，提示转染后既有抗原有的表达，又有病毒的复制。另外，用两种ＤＨＢＶＤＮＡ单体质粒体内转染２ｄｘ     

反式作用丁型肝炎病毒核酶体外切割活性的研究

丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ)在复制过程中 ,基因组ＲＮＡ及复制产生的抗基因组ＲＮＡ均具有自我裂解的活性———核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)活性。ＨＤＶ核酶是在所发现的核酶类型中唯一在人体的细胞中具有天然裂解活性的核酶。通过对ＨＤＶ核酶的研究 ,已经确定了 85ｎｔ长度的核酶活性区 ,并且其二、三级结构也有了阐明。本文根据ＡｎｎｅＴ等人提出的ＨＤＶ核酶自我裂解时的假结样 (ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ ｌｉｋｅ)二级结构 ,将 85ｎｔ的ＨＤＶ核酶从其Ｊ(1/ 2 )连接处分成两段 ,一段作为核酶 ,一段作为底物 ,设计ＨＤＶ核酶的反式作用形式 ;将反…     

丁型肝炎病毒感染树肝组织中Fas和ICE表达的初步研究

我们采用免疫组化技术检测感染丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ )树肝组织中ＨＤＡｇ、Ｆａｓ和ＩＣＥ表达 ,并应用免疫组化双重染色分析病毒抗原、Ｆａｓ和ＩＣＥ表达之间的关系。1　材料和方法1 1　标本来源　 30份感染ＨＤＶ树肝组织 ,取自本科建立的感染ＨＤＶ树经免疫组化和原位杂交证实ＨＤＶ在肝细胞中稳定复制、表达 ,且伴ＡＬＴ升高。1 2　ＨＤＡｇ检测　采用ＳＰ法 ,ＳＰ检测试剂盒购自情士德生物工程有限公司 ,ＨＤＶ多克隆抗体由本室用ＨＤＶＡｇ合成肽免疫家兔制备而成 ,工作浓度 1∶12 0 ,ＨＤＶＲＮＡ原位杂交检测试剂盒购自华西…     

HBV基因组转梁对小鼠NIH3T3细胞内基质金属蛋白酶组织抑制？…

目的：阐明乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因组转染对基质金属蛋白酶组织抑制因子的转录调控作用。方法：应用钙磷酸钙转染技术构建表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞克隆，以该细胞为模型，应用原位杂交技术测定细胞内特异性ＴＩＭＰ ＲＮＡ含量变化。结果：表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ细胞内ＴＩＭＰ１和ＴＩＭＰ２ ＲＮＡ含量显著升高。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

中国湖南株丁型肝炎病毒cDNA（443－870）片段的克隆和序列分析

取１例湖南丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ阳性血清，经强变性剂法抽提ＨＤＶＲＮＡ，逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增的ＨＤＶＣＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１８质粒中，获得了中国湖南株ＨＤＶＣＤＮＡ（４３３－８７０）片段克隆，ＤＮＡ测序结果显示，该片段（４３８ｈｐ长，包括一端ＰＣＲ引物２５ｈｐ）与已知的美国、意大利、法国、诺鲁和中国台湾５株ＨＤＶｃＤＮＡ相同片段比较，同源性分别为９１．３％，９４．５％，９１．３％，８４．５％和８９．３％，其中与ＨＤＶＲＮＡ复制密切相关的第一个高度保守区与美国株、意大利株和法国株完全同源。     

丁型肝炎病毒RNA中核酶和研究进展

丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ中存在二个核酶，本文就近几年对ＨＤＶＲＮＡ中核酶的发现、位置、所需的碱基、二级结构及其对核酶的作用、体外作用条件、影响因素等研究和研究ＨＤＶＲＮＡ中核酶的意义作一综述。     

HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的：研究乙型肝炎病毒 Ｘ 基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的方法构建 Ｈ Ｂ Ｖｘ 基因真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ，用脂质体将真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ转染入肝癌细胞 Ｈ Ｃ Ｃ９２０４ ， Ｇ４１８ ５００ ｍｇ· Ｌ－ １ 筛选，获得稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的细胞，阿霉素２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡，稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的肝癌细胞凋亡率比未进行基因转染的肝癌细胞凋亡率低。结论： Ｈ Ｂｘ 蛋白可抑制阿霉素诱导的肝癌细胞调亡。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。