反义RNA抑制肝癌细胞株端粒酶活性与p16、p21表达的关系

目的：观察反义端粒酶ＲＮＡ对ＳＭＭＣ７２２１细胞的作用,并检测ｐ１６、ｐ２１的表达情况,探讨端粒酶在肝癌发生过程中的可能作用及反义端粒酶ＲＮＡ在肝癌治疗中的意义。方法：经脂质体介导的方法将ｐＢＢＳ２１２－ｈＴＲ（反义端粒酶ＲＮＡ真核表达载体）导入ＳＭＭＣ７７２１细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、电镜、免疫组化技术结合图像分析,在检测ＳＭＭＣ７７２１／ｐＢ     

正常人淋巴细胞端粒酶活性的观察

目的：探讨正常人外周血淋巴细胞端粒酶活性表达情况。方法：采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）法测定正常人淋巴细胞经植物血凝素（ＰＨＡ）刺激前后端粒酶的活性水平及重组人白细胞介素１２（ｒｈＩＬ－１２）对端粒酶活性的影响。结果：正常人外周血静息淋巴细胞有低水平的端粒酶活性表达,但经ＰＨＡ刺激后活性明显升高,没有发现ｒｈＩＬ－１２对端粒酶活性的影响。结论：正常人外周血淋巴细胞可表达端粒酶     

端粒酶反义腺病毒载体对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶的抑制作用

端粒酶ＲＮＡ的反义地人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７细胞端粒酶活性的影响。方法用重组腺病毒转移并表达端粒酶ＲＮＡ的反义ｃＤＮＡ,采用基因重组腺脂质体共转当闰酶反义重组病毒,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定病毒的整合功能,用ＴＲＡＰ－ 染法检测端粒酶活性。结果ＭＣＦ－７细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。对对照组ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７、ｖＡｄ－ＡＡＶ细胞相比,反义病毒感染后的细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。与对照组ＭＣＦ     

硫代反义寡核苷酸体外对HDV的抑制作用

观察硫代反义寡核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＤＮ）体外对ＨＤＶ的抑制作用。方法在ＨＤＶ／ＨＢＶ感染人胎肝细胞中加入不同浓度的针对ＨＤＶ ＳｔｅｍⅠ区６８４－６９８位核苷酸的１５聚Ｓ－ＡＳＯＤＮ,分别采用ＥＬＩＳＡ和斑点杂交法检测上清液中ＨＤＡｇ和细胞中ＨＤＶ ＲＮＡ。结果ＨＢｓＡｇ、ＨＤＡｇ在感染后第２天至第１６天均可测出,以第４天至第１２天达高峰,加入Ｓ－ＡＳＯＮＤ（２、４、６μＭＯＬ／ｌ）ＲＧ ２ＧＤ ,     

IL—1受体相关激酶1和2协同调控IL—1诱导的NF—？…

目的 研究细胞介素１受体相关激酶１（ＩＲＡＫ－１）和ＩＲＡＫ－２在白细胞介素１（ＩＬ－１）诱导核因子－кＢ（ＮＦ－кＢ）活化中的作用。方法 Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导反义和ＩＲＡＫ－１寡核苷酸和反义ＩＲＡＫ－２寡核苷酸转染ＨｅｐＧ２细胞。用逆转录ＰＣＲ法检测ＩＲＡＫ－１ ｍＲＮＡｔ ＩＲＡＫ－２ ｍＲＮＡ表达水平,以夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＮＦ－кＢ的活化。结果 （１）反义ＩＲＡＫ－１寡核苷酸和反义ＩＲ     

IL-4基因转染诱导肝母细胞瘤分化及抑制端粒酶活性

目的 研究人白细胞介素４（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４,ｈＩＬ－４）基因转染对肝母细胞瘤细胞的诱导分化和对端粒酶活性的影响。方法 以逆转录病毒载体（ＰＬ－ＩＬ－４－ＳＮ）将ｈＩＬ－４基因导入人肝母细胞瘤细胞系Ｈｅｐ Ｇ２细胞。台盼蓝拒梁,放射免疫测定,流式细胞仪细胞周期分析,原位杂交,ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ等方法检测基因转染后细胞形态,甲胎蛋白合成,原癌基因的表达及端粒酶活性变化。     

肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达 …

目的 采用多种方法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心区基因和表达产物在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）组织中的分布及其在ＨＣＣ发生和发展中的作用。方法 对３９例ＨＣＣ患者进行免疫组化和原位杂匀的检测。ＩＳ－ＲＴ－ＰＣＲ法用于检测并定位ＨＣＶ－ＲＮＡ。微切组织的ＲＴ－ＰＣＲ法分别检测癌与癌旁组织中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,以便能够控制扩增产物的来源。同时还进行 血清学ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ的检测。结果 血清ＥＬＩＳＡ的阳     

白介素—1受体相关激酶—2调控白介素—1诱导的NK—kB活化

目的 研究白介素－１（ＩＬ－１）受体相关激酶－２（ＩＲＡＫ－２）在ＩＬ－１诱导ＮＦ－ｋＢ活化中的作用。方法 分别以逆转录ＰＣＲ法和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交法,检测Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的反义Ｉ－ＲＡＫ－２寡核苷酸转染的人脐静脉内皮细胞中,ＩＲＡＫ－２ｍＲＡＫ－２寡核苷酸转染的人脐静脉内皮细胞中,ＩＲＡＫ－２ｍＲＮＡ和蛋白表达水平。用夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＮＦ－ｋＢ的活化。结果 反义ＩＲＡＫ－２寡核苷酸可     

乳癌组织端粒酶活性表达及其与p16基因的关系

目的：探讨乳房恶性肿瘤组织中端粒酶活性的表达情况及ｐ１６抑癌基因的影响。方法：应用端粒重复放大程序－酶标法（ＴＲＡＰ－ＥＬＩＳＡ）及ＴＲＡＰ－银染法检测３５例有乳癌组织及２４例良性肿瘤组织中的端粒酶活性,并采用多重ＰＣＲ技术对乳癌组织的ｐ１６基因的缺失空谈进行了分析,结果：３５例乳癌标本中有２８例端粒酶活性表达为阳性（８０％）,而２４例乳房良性肿瘤标本中仅１例端粒酶活性表达阳性（４．１％）。此外３５例乳癌标本中的１５例存在有ｐ１６基因的外显子２及外显子１的缺失（４２．８％）,而该１５例中有１４例被检测为端粒酶活性阳性（９３．３％）,但２０例未缺失标本的端粒酶阳怀率仅为７０％（１４／２０）。结论：端粒酶活性与乳房肿瘤组织的恶性程度密切相关,提示端粒酶参与了肿瘤的形成过程,而端粒酶活性的增高与ｐ１６抑癌基因的缺失突     

IL—1R相关激酶—1和磷脂酰肌醇3—激酶协同调控IL—1诱导？…

为研究ＩＬ－１Ｒ相关激酶１（ＩＲＡＫ－１）和磷脂酰肌醇３－激酶（ＰＬ３－激酶）在ＩＬ－１诱导ＮＦ－κＢ活化中,本文采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导反义ＩＲＡＫ－１寡核茜酸或反义ＰＩ３－激素寡核苷酸转染ＨＥｐＧ２细胞后,用Ｗｅｓｔｅｍ杂交检测ＩＲＡＮ－１和ＰＩ３－激素表达水平,以Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法检测ＮＦ－κＢ的活化。结果表明,①反义ＩＲＡＫ－１寡核苷酸和反义ＰＩ３－激酶寡核苷酸分别抑制ＩＲ     

端粒酶反义核酸对乳腺癌细胞生长的抑制作用

为了探讨针对人类端粒酶RNA（hTR）基因的反义寡核苷酸（AS－ODN）对乳腺癌细胞系MCF－7的影响，将AS－OND作用于细胞。进行细胞计数，MTT比色法测细胞生长抑制率，PCR－ELISA法测端粒酶活性，流式细胞仪测细胞周期与凋亡。结果表明该AS－ODN能抑制MCF－7细胞生长，降低端粒酶活性并诱导细胞凋亡。针对hTR的AS－ODN对治疗恶性肿瘤有潜在意义。     

反义端粒酶基因表达抑制人癌细胞恶性表型

目的 观察端粒酶基因ｈＴＲＴ,ｈＴＲ反义表达对癌细胞生物学行为的影响,探讨改变端粒酶基因表达在肿瘤治疗中的作用。方法 通过反义ｈＴＲＴ基因转染人ＨｅＬａ细胞系,反义ｈＴＲ寡核苷酸处理人肺巨细胞癌系ＰＧ,观察其对肿瘤细胞生长及恶性表型的影响。     

Detection of telomerase in hepatocellular carcinomas using a PCR ELISA assay: comparison with hTR expression

BACKGROUND: While telomerase is undetectable in most normal somatic tissues, telomerase activation has been detected in many immortal cell lines and various cancers. AIM: To investigate telomerase expression in hepatocellular carcinoma, and to assess the expression of the RNA component of telomerase, hTR. METHODS: 39 hepatocellular carcinomas were studied using a telomerase polymerase chain reaction (PCR) enzyme linked immunosorbent assay, which does not require radioactive PCR amplification and yields a semiquantitative measurement. Expression of hTR was also assessed by a non-radioactive in situ hybridisation procedure. The correlations between these two markers and the clinicopathological data were analysed. RESULTS: Telomerase activity was detected in 23 of 39 hepatocellular carcinoma specimens (59%). Comparison of hepatocellular carcinoma with and without telomerase expression, or with high and low telomerase (10 cases v 13 cases), showed no differences in the principal clinicopathological data. Although median survival was lower in the group with detectable telomerase activity than in that with undetectable activity (510 v 720 days) the difference was not significant (log-rank test, p = 0.08). hTR expression was detected in 11 of 14 cases of hepatocellular carcinoma tested (78%) and in four of 12 samples of adjacent non-cancerous tissue (33%). Five tumours and four non-cancerous tissues were positive for hTR, whereas no telomerase activity was detected in these. CONCLUSIONS: The presence of telomerase activity in hepatocellular carcinomas is confirmed. No correlation was observed between clinicopathological data and telomerase expression in hepatocellular carcinoma, but survival seemed better in the absence of telomerase expression. hTR seems to be more widely expressed than telomerase.     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

hTR-siRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究

目的:构建RNA干扰(RNAi)腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用.方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒Ad-hTR-siR-NA,表达靶向hTR的小干扰RNA分子(siRNA),用100 MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系,再用TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性、Real-time PCR测定hTR的mRNA水平、流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶(hTERT)的蛋白变化.结果:感染了Ad-hTR-siRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低,其中以HeLa细胞降低最明显,其端粒酶活性抑制率达到58.87%,hTR的mRNA表达下调70.21%,细胞凋亡率为29.7%,但hTERT的蛋白表达并不被阻断.结论:Ad-hTR-siRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达,诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性;此结果提示Ad-hTR-siRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值.     

千金藤素诱导人肺腺癌LTEP-a-2细胞中miRNA表达变化的研究

目的:观察千金藤素对人肺腺癌LTEP-a-2细胞生长的影响,探讨细胞中相关微小RNA(miRNA)的表达变化,为明确千金藤素的抗肿瘤机制提供科学依据。方法:在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的千金藤素作用后,MTT法检测LTEP-a-2细胞的生长抑制率;光镜下观察千金藤素作用后LTEP-a-2细胞的形态学变化;流式细胞术分析不同浓度千金藤素对LTEP-a-2细胞凋亡的影响;提取细胞miRNA,real-time PCR检测不同浓度千金藤素作用之后细胞中的let-7c、miR-34a和miR-34b的表达情况。结果:MTT法检测结果表明,千金藤素能够抑制LTEP-a-2细胞活力,呈现剂量依赖性;倒置显微镜下可见,随着千金藤素浓度的升高,细胞固缩的程度逐渐加深;流式细胞术分析发现,不同浓度千金藤素均可导致的LTEP-a-2细胞凋亡率增加;real-time PCR结果表明,千金藤素可以使LTEP-a-2细胞中的let-7c、miR-34a和miR-34b表达升高。结论:千金藤素可以抑制LTEP-a-2细胞生长,诱导细胞凋亡;千金藤素升高细胞中let-7c、miR-34a和miR-34b表达,提示这些miRNA在LTEP-a-2细胞具有抑癌基因的功能。     

1,25-二羟基维生素D3协同转染反义端粒酶RNA诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的观察在抑制肝癌细胞端粒酶活性表达情况下,1,25-二羟基维生素D3(1,25-VD3)对肝癌细胞凋亡的影响。方法经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,将其分为对照组、药物组、转染组和转染药物组。添加1,25-VD3,分别作用于转染药物组、药物组,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)和电子显微镜检测肝癌细胞凋亡。结果转染组和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。对照组、药物组、转染组和转染药物组细胞凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%;差异有显著统计学意义(P<0.01)。超微结构检查也证实存在凋亡发生。1,25-VD3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞有促细胞凋亡作用,两者协同对肝癌细胞凋亡作用显著增强。结论转染反义端粒酶RNA,可降低肝癌细胞端粒酶活性,可显著增强1,25-VD3对肝癌细胞的促凋亡作用,并且对细胞的增殖也存在明显的抑制作用。