呼吸道合胞病毒抑制JAK/STAT信号通路减少干扰素-β的表达

目的:探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染上皮细胞早期对酪氨酸蛋白激酶/信号传导与转录活化因子(JAK/STAT)信号通路和β干扰素(IFN-β)表达的影响。方法:RSV体外感染人喉癌上皮细胞(Hep2)0,1,2,4,8,12,24 h后分别应用酶联免疫吸附法(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染后各个时间段IFN-β的浓度以及STAT1、STAT2 mRNA的表达水平。结果:RSV感染Hep2细胞后,IFN-β浓度于第2小时后略有上升,但与未感染细胞基础水平无差异性变化(P>0.05)。STAT1、STAT2 mRNA表达第1小时即上升,第2小时达峰值,随后逐渐下降,在第24小时达最低值(P<0.05)。结论:RSV感染Hep2细胞早期上调STAT1、STAT2 mR-NA,继而抑制其转录,对上皮细胞IFN-β的分泌无明显影响。     

呼吸道合胞病毒对小鼠骨髓树突状细胞Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用

目的研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)Ⅰ型干扰素(IFN)信号通路的影响。方法从Balb/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs。将BMDCs接种于6孔板中过夜,然后用不同感染复数(MOI)的RSV感染细胞,用RT-PCR法检测RSV的非结构蛋白-1(NS-1)和非结构蛋白-2(NS-2)基因在BMDCs中表达。在另一组实验中,BMDCs经RSV感染24 h后,分别用IFN-β或IFN-γ刺激,然后收集细胞和提取蛋白,用Western blotting法检测IFN信号通路的STAT1、STAT2及磷酸化的STAT1(P-STAT1)、STAT2(P-STAT2)等蛋白的表达。结果以不同MOI的RSV感染BMDCs 24 h后,RSV NS1和NS2的表达随着感染MOI的增加而逐渐增强,说明RSV病毒能在BMDCs细胞中复制。RSV感染能增加IFN-β信号通路STAT1和STAT2蛋白的表达,但却抑制了P-STAT1和P-STAT2的表达,而紫外线灭活的RSV(UV-RSV)感染对它们的表达却没有影响;而且RSV感染对Ⅱ型IFN(IFN-γ)诱导的STAT1的磷酸化也没有抑制作用。结论RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2磷酸化,从而抑制Ⅰ型IFN信号通路,这可能是RSV逃避宿主抗病毒免疫的机制之一。     

呼吸道合胞病毒对小鼠骨髓树突状细胞Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用

目的 研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)Ⅰ型干扰素(IFN)信号通路的影响.方法 从Balb/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs.将BMDCs接种于6孔板中过夜,然后用不同感染复数(MOI)的BSV感染细胞,用RT-PCR法检测RSV的非结构蛋白-1(NS-1)和非结构蛋白-2(NS-2)基因在BMDCs中表达.在另一组实验中,BMDCs经RSV感染24 h后,分别用IFN-β或IFN-γ刺激,然后收集细胞和提取蛋白,用Western blotting法检测IFN信号通路的STAT1、STAT2及磷酸化的STAT1(P-STAT1)、STAT2(P-STAT2)等蛋白的表达.结果 以不同MOI的RSV感染BMDCs 24 h后,RSV NS1和NS2的表达随着感染MOI的增加而逐渐增强,说明RSV病毒能在BMDCs细胞中复制.RSV感染能增加IFN-β信号通路STAT1和STAT2蛋白的表达,但却抑制了P-STAT1和P-STAT2的表达,而紫外线灭活的RSV(UV-RSV)感染对它们的表达却没有影响;而且RSV感染对Ⅱ型IFN(IFN-γ)诱导的STAT1的磷酸化也没有抑制作用.结论 RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2磷酸化,从而抑制Ⅰ型IFN信号通路,这可能是RSV逃避宿主抗病毒免疫的机制之一.     

呼吸道合胞病毒感染小鼠Th17细胞亚群的变化

目的观察辅助性T淋巴细胞17（Th17）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染小鼠肺部炎症中的变化,探讨其在RSV感染后宿主免疫机制中的作用。方法 30只3～5周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组（18只）和对照组（12只）。实验组每只小鼠鼻腔滴入0.1 mL滴度为107.5TCID 50/mL的病毒液,对照组鼻腔滴入0.1 mL的2.5%灭活鸡血清的DMEM维持液。在处理后的第1、4、8 d分别处死小鼠,并留取肺脏和肺门淋巴结。用HE染色观察RSV感染后肺组织病理变化;实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺组织中RSV-F、IL-17A、IL-17F和IL-23p19 mRNA表达水平;流式细胞术检测小鼠肺门淋巴结中Th17细胞水平。结果在RSV感染后第4 d小鼠肺组织出现典型间质性肺炎表现,第8 d炎性细胞明显减少;肺组织中RSV病毒的相对表达量在第4 d为9.208±0.548,较第1 d显著增多（P〈0.01）,到第8 d则较第4 d显著减少（P〈0.01）;肺组织中IL-23p19和IL-17A等细胞因子的表达在RSV感染后也呈现增高的趋势,并在第4 d达到高峰,但IL-17F mRNA表达在RSV感染后不同时间点与对照组比较无显著变化（P〉0.05）;RSV感染后第4 d和第8 d小鼠肺门淋巴结Th17亚群比例分别为（0.370±0.043）%和（0.853±0.048）%,均明显高于相应的对照组（P〈0.05）,而且第8 d的Th17比例也显著高于第4 d（P〈0.01）。结论在RSV感染小鼠导致的肺部炎症反应过程中,出现肺组织中IL-17A的表达增加和肺门淋巴结Th17细胞水平增高,说明Th17细胞可能参与宿主的抗病毒免疫过程。     

特异性脱氧核酶对小鼠呼吸道合胞病毒感染的抑制作用

目的 研究特异性抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)N基因的脱氧核酶DZ1133在小鼠体内对病毒复制和气道炎症的影响.方法 RSV感染BALB/c小鼠滴鼻给予DZ1133及其变异体、反义寡核苷酸AS1133,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,RT-PCR检测病毒mRNA表达,支气管肺泡灌洗液白细胞计数,ELISA检测TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平,肺组织病理学分析炎症情况.结果 0.2、0.4 mg和0.8 mg DZ1133治疗组小鼠肺组织病毒滴度分别为(2.75±0.21)×105、(1.86±0.20)×105PFU/g和(1.02±0.22)×103PFU/g,与感染对照组小鼠(7.94±0.42)×105PFU/g比较明显下降(P<0.01),上述各剂量治疗组小鼠肺组织病毒mRNA表达与感染对照组比较分别下降30.51%、47.38%(P<0.05)和53.97%(P<0.01).0.4 mg DZ1133治疗降低RSV感染小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数,改善肺组织病理学损伤(P<0.05),对TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平无显著性影响(P>0.05).结论 特异性脱氧核酶DZ1133在小鼠体内有效抑制RSV复制、减轻气道炎症,是有效的抗RSV途径.     

慢性EAE模型C57 BL/6J小鼠脑和脊髓EBI3和p28.mRNA表达

目的：观察IL-27两个亚单位EBI3 mRNA和p28 mRNA在慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型C57BL/6J小鼠脑和脊髓动态表达的变化,探讨其在EAE发病机制中的作用。方法：72只近交系无特定病原体的6～8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、佐剂组和慢性EAE模型组,采用RT-PCR技术观察不同时期脑和脊髓EBI3 mRNA和p28 mRNA的表达变化。结果：EAE组小鼠在发病初期即有EBI3 mRNA和p28 mRNA的表达升高,在疾病高峰期迅速增加,并在慢性期仍维持在较高水平;与空白对照组和佐剂组相比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。空白对照组小鼠脑和脊髓EBI3 mRNA和p28 mRNA的表达与佐剂组相比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：IL-27有可能在早期促进EAE发病,并维持最后阶段的炎症反应。     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化TLR7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化,初步研究TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制。方法以RSV滴鼻感染BALB/c鼠建立急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特(Imiquimod)处理,分别于感染后4、8、12、24 h不同时间点处死小鼠取肺组织,并以未感染病毒的BALB/c鼠为正常对照组。①HE染色观察肺的病理学改变;②用TRIzol提取肺组织总RNA,RT-PCR法检测鼠肺内TLR7、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7),干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β)及RSV融合蛋白基因(F基因)mRNA的表达;③Western blot法检测鼠肺组织TLR7蛋白的表达变化;④空斑形成实验(PFU)测定各组不同时间点肺组织匀浆中RSV滴度。结果①HE染色显示肺部炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度随感染时间延长而加重,经Imiquimod干预后肺部炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻;②在mRNA转录水平,RSV感染早期,感染组上调TLR7、IRF3/7、IFN-α/β、RSV F基因的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imi-quimod处理组,TLR7、IRF7、IFN-α的mRNA比感染组相同时间点的表达量明显升高,且升高有显著性差异,而IRF3、IFN-β表达量在Imiquimod干预后与RSV感染组相比升高不明显;而RSV F基因的mRNA表达量较RSV感染组明显下降;③在蛋白水平,RSV感染组上调TLR7蛋白的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imiquimod处理组,TLR7蛋白表达量较感染组显著升高;④RSV感染BALB/c鼠肺后,肺组织匀浆中RSV滴度随感染时间的延长而增加;给予TLR7激动剂Imiquimod处理组,RSV复制滴度水平较感染组明显减少。结论 RSV感染BALB/c鼠后通过活化TLR7,诱导Ⅰ型IFN的产生。用Imiquimod激动TLR7后,Ⅰ型IFN表达量较RSV感染组明显升高,RSV F基因和肺组织匀浆中RSV滴度水平明显减少,以及肺部炎症减轻,表明RSV引起的抗病毒免疫机制与TLR7活化的转导途径有关;而且激动TLR7后,IRF7和IFN-α的表达较IRF3和IFN-β明显升高,表明了IFN-α可能是主要通过IRF7通路由TLR7诱导产生的最主要Ⅰ型IFN。     

Toll3受体在呼吸道合胞病毒感染中作用的实验研究

目的探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮A549细胞后,Toll样受体3（TLR3）的水平变化及其产生的I型干扰素的抗病毒作用。方法RSV感染体外培养的人肺上皮A549细胞,并给予TLR3特异性抗体处理,分别感染4h、8h、12h、16h和24h后收集各组细胞。未感染病毒的细胞作为对照组。lit—PCR法检测TLR3、IFN-α、IFN—β,RSVF蛋白的mRNA表达水平变化。结果RSV感染A549细胞后,TLR3、IFN—α、IFN-β,RSVF蛋白的mRNA表达量均升高且有时间依赖性。结论RSV感染A549细胞后可上调TLR3表达,其活化细胞介导产生的I型干扰素能起到抗病毒作用。     

呼吸道合胞病毒(RSV)对干扰素(IFN)信号通路STAT蛋白核转移的影响

 目的 研究呼吸合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)后,对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(interferon,IFN)诱导的JAK/STAT通路蛋白活化后核转移的影响。方法 从BALB/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs。将BMDCs接种于带小室的玻片上,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的RSV感染细胞,并设紫外线灭活的RSV(UV-RSV)和培养液(media)刺激为对照。在培养24 h后,分别用100 IU/mL的IFN-β刺激30 min或0.64 pmol/L的IFN-γ刺激45 min,然后进行免疫荧光染色。在荧光显微镜下计数STAT蛋白核转移阳性细胞的百分比,比较各组间的差异。结果 在未感染的BMDCs中,STAT1和STAT2蛋白主要存在于细胞质中,当用IFN-β 刺激BMDCs后可见到明显的STAT1和STAT2蛋白向细胞核转移,核转移阳性细胞百分比分别为89.0%±4.6%和83.7%±5.1%,与未处理组(NT组)相比有明显差异(P<0.01)。而RSV感染后,发现STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数较IFN-β 刺激组明显减少(P<0.01),说明RSV感染可以抑制IFN-β诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移。而应用UV-RSV感染后与IFN-β刺激组相比,STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数却未见明显减少(P>0.05)。用IFN-γ 刺激BMDCs后也可见到明显的STAT1蛋白向细胞核转移(阳性细胞为85.3%±6.4%);而RSV感染后与IFN-γ刺激组相比,STAT1核转移阳性细胞数(79.3%±4.9%)却未见明显减少(P>0.05)。结论 RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移,而对II型IFN诱导的STAT1蛋白的核转移却没有影响。     

旋毛虫对三硝基苯磺酸诱导肠炎小鼠Th1/Th2类细胞因子基因表达的影响

目的：研究旋毛虫对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的实验性小鼠肠炎模型Th1/Th2类细胞因子基因表达的影响。方法：雌性BALB/c小鼠随机分为50%乙醇对照组、旋毛虫（T. spiralis）应用组、 TNBS诱导肠炎模型组、预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组，（每组小鼠取材时保证6只以上）。采用RT-PCR方法观察感染旋毛虫和未感染旋毛虫小鼠于TNBS诱导肠炎后3 d和7 d时不同基因的表达变化，包括小鼠脾脏中IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA和结肠中IL-10 mRNA的表达量。结果：预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d脾脏中IFN-γ mRNA的表达量与模型组比较差异无显著性(P>0.05)，在造模后7 d脾脏中IFN-γ mRNA的表达量低于模型组（P<0.05）， IL-4 mRNA的表达量于3 d和7 d时均高于模型组（P<0.05）。预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d和7 d脾脏和结肠中IL-10 mRNA的表达量均高于模型组（P<0.05）。结论：旋毛虫对TNBS诱导的实验性小鼠肠炎外周免疫作用机制可能通过下调炎症性肠病过度的Th1型免疫反应、上调Th2型免疫反应而实现；IL-10既作为Th2类细胞因子又作为Tr1型细胞因子对实验性小鼠的肠道局部和外周免疫均产生重要调节作用。     

呼吸道合胞病毒增加小鼠肺组织的高迁移率族蛋白B1的表达和释放

探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠模型肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达和释放.方法 18只Balb/C小鼠,随机分成3组,分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、RSV组、RSV+利巴韦林治疗组;RSV感染小鼠7d后处理:支气管肺泡灌洗液(BALF)作细胞分类计数,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BALF上清中自细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)及HMGB1含量,左肺行苏木精-伊红(H E)染色,蛋白免疫印迹方法检测右肺组织HMGB1表达.结果 1、RSV感染诱导了小鼠肺组织TH1型反应:BALF中的IFN-γ含量增加,IL-4含量减低.与对照组比较,RSV组BALF中细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞均显著增加(P<0.05),RSV+利巴韦林治疗组上述细胞数显著减低(P<0.05).HE染色:RSV组可见黏膜下及管壁周同中性粒细胞,淋巴细胞等炎症细胞浸润.2、BALF中HMGB1含量变化:与对照组比较,RSV组显著升高(P<0.05)、利巴韦林治疗组显著降低(与RSV组比较,P<0.05).3、肺组织HMGB1的表达情况:与对照组比较,RSV组明显升高(P<0.05)、治疗组无显著降低(与RSV组比较,P>0.05).结论 HMGB1在RSV感染小鼠的肺组织中表达和释放明显增加,提示其可能参与了RSV感染相关肺疾病的发生发展.     

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

目的：探讨 Toll 样受体7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染 A549细胞诱导产生 I 型干扰素（IFN）抗病毒免疫反应中的作用。方法实验分正常对照组、RSV 感染组、TLR7 siRNA 沉默组,分别于感染的4、8、12、24 h 后收集各组细胞以及培养上清液。TLR7 siRNA 通过瞬时转染 A549细胞,半定量 RT-PCR 法检测 TLR7基因沉默效果;TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,检测 TLR7、干扰素调节因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的 mRNA 表达量变化;通过 Western blot 法检测 TLR7蛋白表达量;ELISA 法检测感染不同时间点 A549细胞培养上清液中 IFNα／β含量的变化。结果①转染24 h 后 TLR7 siRNA-2有效抑制 TLR7 mRNA 表达;② RSV 感染A549细胞后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量均升高,并与 RSV 感染之间存在时间依赖性关系;沉默 TLR7后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量较感染组均有明显下降;③ RSV 感染 A549细胞后,明显上调细胞培养上清液中 IFN-α／β的水平,TLR7 siRNA 沉默组 IFN-α／β的表达水平较 RSV 感染组均下降,差异有统计学意义,且 IFN-α的表达量下调更为显著。结论RSV 感染A549细胞后,TLR7被活化能够诱导产生I 型IFN,发挥抗病毒作用,且TLR7诱导产生的I 型IFN 以IFN-α为主。     

呼吸道合胞病毒对上皮细胞TLR3/4和SOCS1/3表达的影响

目的:探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染上皮细胞中抗病毒信号激活以及细胞因子负调节系统对细胞因子分泌的影响。方法:应用ELISA法检测RSV感染人喉癌上皮细胞(Hep2)培养上清中0,1,2,4,8,12,24 h干扰素α(IFNα-)的浓度;RT-PCR检测病毒感染后各时段上皮细胞内细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)1,3和Toll样受体(TLR)3,4的mRNA表达水平。结果:RSV感染上调Hep2细胞SOCS3 mRNA的表达(P<0.05),SOCS1的表达先增高后减低,但无统计学意义;TLR3,TLR4 mRNA的表达增高表现为时间依赖性(P<0.05);IFNβ-的表达在RSV感染后短暂升高而后迅速降低并低于基础表达量(P<0.05)。结论:RSV感染Hep2细胞后上调TLR3,TLR4和SOCS3 mRNA的表达,抑制IFN-α的分泌,提示病毒复制可能通过上调SOCS3而拮抗TLR途径激活的宿主抗病毒免疫应答。     

The antiviral role of Toll-like receptor 7 in BALB/c mice infected with respiratory syncytial virus

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV) 感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用.方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组.以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白 (RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变.结果 ① RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;② 咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mRNA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻.结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻.     

呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染所致肺炎与TLR4-NF-κB信号通路关系的初步研究

目的 探讨呼吸道合胞病毒( RSV)合并肺炎克雷伯菌( Kp)感染SD大鼠后,初步研究其所致肺炎与TLR4-NF-κB信号转导通路的关系. 方法 60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、RSV组、Kp组及RSV+Kp组,以RSV、Kp滴鼻感染SD大鼠,分别于感染后第0、1、3、5、7天不同时间点,测量其体重、肺指数( LI )的变化;HE染色观察肺的病理学改变;RT-PCR法检测肺组织中TLR4、NF-κB的mRNA表达;Western blot检测NF-κB蛋白的表达;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α( TNF-α)和白细胞介素-1β( IL-1β)含量的变化.结果 与正常对照组相比,RSV组和Kp组均存在弥漫性肺泡间隔增厚和炎症细胞浸润,且随感染时间的延长,肺泡结构破坏逐渐加重, LI、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、NF-κB 蛋白、TNF-α和IL-1β的表达均升高,并与RSV和Kp感染之间存在时间依赖性关系;RSV+Kp组 LI、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、NF-κB蛋白、TNF-α和IL-1β的表达量进一步升高,肺组织炎症明显加剧. 结论 RSV和Kp混合感染具有协同作用,加重肺部炎症;RSV合并Kp感染可能通过 TLR4-NF-κB途径诱导肺部炎症反应,释放细胞因子TNF-α和IL-1β等.     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用。方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组。以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白(RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变。结果①RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;②咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mR-NA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻。结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻。     

卡介菌多糖核酸免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的 观察卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫保护作用及其免疫学机制。方法 将BALB／c小鼠48只随机分成BCG—PSN免疫治疗组和结核菌感染对照组,每组24只。两组小鼠制成结核分枝杆菌感染模型。感染后1周,每天分别腹腔内注射BCG—PSN（10mg／kg）或生理盐水（10mL／kg）,连续7d。感染后3周和4周每组处死12只小鼠,检测小鼠体重以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数,用real—time PCR法测定肺、脾组织IFN-γmRNA、IL-10mRNA和IL-4mRNA的表达。结果 感染后4周,治疗组小鼠体重和脾脏重量高于对照组,肺脏重量低于对照组,且肺部病变较轻。感染后3周和4周,治疗组小鼠肺、脾组织结核菌落均低于对照组,小鼠肺组织IFN-γmRNA表达与对照组无差别,IL-10mRNA和IL-4mRNA的表达低于对照组。感染后3周,治疗组小鼠脾组织IFN-γmRNA表达与对照组相似;感染后4周,脾组织治疗组脾组织IFN-γmRNA的表达高于对照组。感染后3周和4周,IL-10mRNA和IL-4mRNA的表达低于对照组。结论 BCG—PSN可减轻结核病小鼠体重下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量,并增强Th1型免疫反应。     

呼吸道合胞病毒感染促进哮喘小鼠气道分泌TSLP和Th2炎症反应

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)对哮喘小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)分泌的影响,以探索RSV对哮喘小鼠Th1/Th2免疫反应的调节作用.方法 雌性BALB/c小鼠32只.随机分成4组,分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、鸡卵白蛋白(OVA)组、RSV组、OVA/RSV组;应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发哮喘;无创肺功能检测小鼠气道反应性,ELISA法检测小鼠血清IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13水平;ELISA法检测气管灌洗液(BALF)TSLP含量并进行细胞分类计数;小鼠肺组织病理观察炎症反应,免疫组化观察小鼠气管上皮细胞TSLP表达水平.结果 RSV感染促进哮喘小鼠呼吸道分泌TSLP增加,OVA/RSV组小鼠TSLP浓度达(2.13±0.05)ng/ml,高于其他组(P<0.01);同时促进IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的分泌,并增加IFN-γ分泌;0VA/RSV组BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数与其他各组比较均明显增加;无创肺功能检测显示OVA/RSV组小鼠气道反应性明显增高,乙酰甲胆碱浓度达6.25 mg/ml时,Penh值(318.66±50.87)明显增加,与其他各组比较具有统计学意义(P<0.01);病理观察显示RSV感染明显加重哮喘小鼠气道炎症细胞浸润;免疫组化染色证实RSV/OVA组小鼠气道上皮细胞TSLP表达量较高.结论 RSV感染可以增加小鼠气道上皮细胞表达TSLP,促进Th2细胞因子的表达,加重哮喘小鼠肺部Th2炎症反应.     

呼吸道合胞病毒感染通过上调细胞因子信号抑制因子调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达

目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)对细胞因子信号抑制因子(SOCS)3,Toll样受体(TLR)3、TLR4 mR-NA表达影响,探讨SOCS3在病毒感染上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的调节效应。方法:设计人SOCS3特异小干扰RNA(si-RNA),转染上皮细胞A549,RSV感染后不同时段,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测细胞不同时间点细胞SOCS3、TLR3、4 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-8的浓度。结果:RSV感染上调A549细胞TLR3、4和SOCS3 mRNA的表达。SOCS3在感染后1 h升高,2 h达到峰值,分别为0 min的2.1倍和6.2倍(P<0.05),随后逐渐恢复至基础水平;TLR3、4在感染后2 h增加,并在24 h内持续表达较高水平。IL-8于24 h开始增高,24 h较基础水平增加25倍;IFN-β虽增高,但与基础水平无统计学差异。抑制SOCS3,对TLR3、TLR4 mRNA无显著性影响,但早期上调IFN-β的表达,IL-8虽有增高,但显著低于对照组。结论:RSV感染早期通过上调SOCS3表达调节上皮细胞差异表达Ⅰ/Ⅱ型细胞因子。     

肺炎克雷伯杆菌对小鼠中性粒细胞表达IL-1β和TNF-α的影响

目的观察肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,Kle.p）感染对小鼠中性粒细胞细胞因子表达的影响。方法以热灭活的Kle.p感染小鼠肺部建立急性肺炎模型，分离并纯化中性粒细胞（PMN），用RT-PCR、Western blotting、ELISA等方法检测PMN中TNF-α和IL-1β的表达改变。结果Kle.p感染促进了早期小鼠中性粒细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的mRNA表达及分泌，TNF-α mRNA表达在感染6h最高，12h后降低；IL-1β的mRNA表达在感染12h最强；24h后两者表达均减弱，但仍显著强于对照组。Western blottin结果显示，感染6h后TNF-α、IL-1β的蛋白表达量最高，24h后表达明显减少。ELISA结果显示，TNF-α分泌量在感染后6h最高，24h后明显降低，但仍较对照组高；IL-1β分泌量峰值在感染12h后出现。结论TNF-α可能主要参与小鼠感染热灭活Kle.p早期的PMN免疫防御功能；而IL-1β则主要参与感染中后期的PMN免疫防御功能。