反义人端粒酶RNA诱导肝癌细胞凋亡的分子生物学机制研究

目的 探讨反义人端粒酶RNA( human telomerase RNA,hTR)基因对肝癌细胞株Bel-7402凋亡的诱导作用及其分子生物学机制.方法 利用前期实验成功转染人端粒酶正、反义RNA基因的肝癌细胞,分为正义转染组(Bel-7402-hTR-EcoRI)、反义转染组(Bel-7402-hTR-BamHI)和空白对照组(Bel-7402).PCR鉴定转染结果,hoechst 33258荧光染色观察3组细胞的变化,实时荧光定量PCR法和Western blot法分别检测凋亡相关基因p53、Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白的表达水平.结果 与正义转染组及空白对照组细胞相比,反义转染组部分细胞出现凋亡特征性改变,p53、Bax的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).结论 反义端粒酶RNA可诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能是通过上调p53和Bax的表达并下调Bcl-2的表达.     

青蒿酯钠诱导人肿瘤细胞凋亡及其分子机制的探讨

目的 研究青蒿酯钠诱导人肝癌细胞凋亡作用及探讨青蒿酯钠诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制.方法 肝癌细胞(BEL-7402)经药物处理后,用荧光显微镜,透射电镜和流式细胞仪分析诱导凋亡作用,采用Western blot检测p53,p21和bcl-2.结果 与对照组相比,经青蒿酯钠处理后,肝癌细胞中p53,p21蛋白表达水平无明显变化,而bcl-2蛋白表达水平降低.结论 青蒿酯钠可诱导人肝癌细胞(BEL-7402)凋亡,其凋亡的分子机制是p53非依赖性的,即与p53,p21无关,而与凋亡调节基因bcl-2下调有关.     

新型钌配合物通过内源性线粒体凋亡通路诱导Bel-7402细胞凋亡的机制

目的 研究钌配合物Ru-HMIP对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其机制.方法 MTI法检测RuHMIP对Bel-7402细胞的杀伤作用;流式细胞术检测其诱导细胞凋亡情况;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS);Western blot检测细胞凋亡相关蛋白.结果 RuHMIP对Bel-7402细胞有较强的杀伤效果;其对细胞毒性作用是通过诱导细胞凋亡方式;Ru-HMIP在Bel-7402细胞中产生过量ROS,并且这种作用及其细胞毒性都可被还原剂乙酰半胱氨酸(NAC)所阻断.Ru-HMIP可以破坏Bel-7402细胞线粒体膜电位;上调Bax,下调Bcl-2,同时激活Caspase-9及Caspase-3.结论 Ru-HMIP可以在体外有效抑制Bel-7402细胞增殖,其作用机制是在细胞内诱发过量ROS,继而通过内源性线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡.     

白花蛇舌草抑制Hela细胞肿瘤活性的体外实验研究

目的探讨中药白花蛇舌草抑制人宫颈癌Hela细胞肿瘤活性的作用及分子生物学机制。方法MTT法检测白花蛇舌草对宫颈癌Hela细胞生长的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态学变化,化学比色法测定Hela细胞活性氧（ROS）产生状态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化染色并用计算机图像分析观察p53基因表达。结果白花蛇舌草可抑制Hela细胞的生长,其效果与药物的浓度和作用的时间相关,倒置显微镜下Hela细胞出现细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪检测到凋亡峰,白花蛇舌草作用后细胞内ROS水平下降,而突变型p53表达降低。结论一定浓度的白花蛇舌草对人宫颈癌Hela细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能与细胞内ROS水平和p53基因调控有关。     

新藤黄酸抑制人肝癌细胞BEL-7402自噬作用研究

目的 观察新藤黄酸（gambogenic acid,GNA）对人肝癌细胞BEL-7402自噬的影响,为GNA抗肿瘤研究提供理论依据。方法 体外培养人肝癌BEL-7402细胞株,采用MTT法检测GNA对人肝癌细胞BEL-7402存活率的影响;倒置显微镜观察给药前后细胞形态变化;单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine,MDC）染色,荧光显微镜观察细胞自噬小体;透射电子显微镜进一步观察自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3）和p62、Beclin1的表达水平及加入自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）和自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）后自噬相关蛋白的表达情况。结果 GNA能显著抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖并呈时效及量效关系;倒置显微镜观察结果显示GNA组细胞随药物浓度增大,细胞悬浮增多,高浓度给药组细胞出现碎片化;荧光显微镜下观察结果显示,随药物浓度的增加,荧光点状聚集增多;透射电子显微镜观察发现,随GNA浓度的增加,细胞内自噬空泡数量增多,与对照组比较,加入自噬诱导剂Rap后,自噬空泡数量显著增多;Western blot法检测结果显示,随GNA浓度的增加,Beclin1、p62、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均增加（P<0.05）,LC3-Ⅰ无明显变化,表明BEL-7402细胞自噬前期被激活,后期进程被抑制。结论 GNA能抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖,其机制可能部分是通过抑制自噬后期自噬体与溶酶体的融合,抑制人肝癌BEL-7402细胞的保护性自噬。     

人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响

目的观察人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响,并初步研究其机制。方法将Bel-7402细胞与人参皂苷Rh(2200、100和50μg/mL)共同培养48 h。MTT法检测人参皂苷Rh2对Bel-7402细胞增殖的影响;流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数;TUNEL技术检测其对Bel-7402细胞凋亡的影响;Western blotting法检测Bel-7402细胞中Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果 MTT结果显示,人参皂苷Rh2能抑制Bel-7402细胞的生长;流式细胞检测显示,人参皂苷Rh2能使细胞停滞于G1期;TUNEL结果显示,人参皂苷Rh2能有效诱导Bel-7402细胞凋亡;Western blotting结果显示,人参皂苷Rh2能上调Bel-7402细胞中Bax的表达,下调Bcl-2的表达。上述结果均在一定程度上呈量效关系。结论人参皂苷Rh2能抑制Bel-7402细胞生长并促进其凋亡,其作用机制可能为上调Bax和下调Bcl-2。     

槲皮素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨槲皮素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖与凋亡的作用.方法 MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡;流式细胞仪检测槲皮素对凋亡相关蛋白Bcl-2、p53表达的影响.结果 槲皮素对HO-8910细胞有增殖抑制作用,呈时间、剂量依赖性;流式细胞术检测结果分析,实验组G1/G0期上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升;流式细胞术结果显示,槲皮素使Bel-2表达下调,而上调p53蛋白的表达.结论 槲皮素在体外能抑制卵巢癌HO-8910细胞的生长,阻止细胞由G1/G0期向S期和G2/M期移行并诱导细胞凋亡,其诱导HO-8910细胞凋亡的机制可能与上调促调亡蛋白p53表达和下调凋亡抑制蛋白Bel-2表达有关.     

DADS诱导小细胞肺癌细胞株NCI-H446凋亡及其分子机制

目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人肺癌细胞株NCI-H446凋亡及其分子机制.方法 流式细胞仪检测DADS诱导NCI-H446细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测NCI-H446细胞内Ca2+水平变化;利用免疫细胞化学法检测NCI-H446细胞内Bcl-2蛋白表达.结果 与对照组相比,DADS处理组细胞的凋亡率显著增加(P＜0.05);DADS处理组细胞内Ca2+水平升高(P＜0.05).DADS下调Bcl-2(P＜0.05).结论 DADS诱导小细胞肺癌细胞株NCI-H446凋亡,其具体机制可能与DADS下调Bcl-2蛋白表达和促进细胞内Ca2+水平升高有关.     

小檗碱对人肝癌Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响

目的观察小檗碱对人肝癌Bel-7402细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用.方法体外培养人肝癌Bel-7402细胞,台盼兰活细胞计数及集落形成抑制实验观察不同浓度小檗碱对Bel-7402细胞的增殖抑制作用,Hochest33258染色观察凋亡形态学变化,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡率.结果小檗碱可显著抑制Bel-7402细胞生长,使集落形成能力明显下降,均呈时间、剂量依赖性.小檗碱处理后72 h,Hochest33258染色可观察到细胞核边集、固缩,有明显凋亡小体形成,流式细胞仪检测出现明显Sub-G1峰.结论小檗碱可以抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖,诱导细胞凋亡,小檗碱可能具有治疗人肝细胞癌的潜在应用价值.     

亚砷酸对人肝癌细胞凋亡及ERK-1蛋白表达的影响

目的探讨亚砷酸对人肝癌细胞BEL-7402凋亡及ERK-1蛋白表达的影响.方法通过体外细胞培养,用流式细胞术观察BEL-7402细胞周期及凋亡率变化;HE染色法、荧光显微镜观察细胞的凋亡形态变化;并用免疫组化法检测细胞ERK-1蛋白的表达.结果亚砷酸(1.0～8.0 μmol/L)能诱导BEL-7402细胞凋亡并阻滞细胞周期于S、G2/M期,呈剂量依赖性;亚砷酸(8.0 μmol/L)作用BEL-7402细胞48 h后, HE染色、荧光显微镜观察可见BEL-7402细胞呈现明显的凋亡形态改变;免疫组化法检测发现8.0 μmol/L的亚砷酸作用48 h 后BEL-7402细胞的ERK-1蛋白表达明显减弱. 结论亚砷酸体外有诱导人肝癌细胞凋亡及降低ERK-1蛋白表达的作用.     

外加极低频交变磁场照射下致吸附纳米FeOx颗粒不同类型肝癌细胞凋亡研究

目的:观察纳米FeOx粒子在100Hz外加极低频交变磁场(extremely low frequency altering electric-magnetic field, EMF)作用下导致的Bel-7402及HepG2两种肝癌细胞凋亡现象,并探讨其分子机制?方法:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测纳米粒子在EMF作用下对不同类型体外培养肝癌细胞Bel-7402及HepG2增殖的影响,流式细胞仪检测不同实验条件下细胞发生的早期凋亡及死亡,运用Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl家族及热休克蛋白-27(Hsp-27)的表达以确定其对细胞影响的分子机制?结果:EMF照射纳米FeOx颗粒吸附HepG2和Bel-7402细胞增殖抑制率分别为(35.54±3.2)%?(76.31±2.3)%(P < 0.05),凋亡率分别为(18.64±6.68)%?(23.34±2.16)%(P > 0.05),两种细胞凋亡率差异不显著?Western-blot实验结果表明两种细胞的Bcl蛋白家族大量表达,细胞发生明显早期凋亡,其中Bel-7402细胞的Bcl/Bax值明显低于HepG2细胞的比值,而Hsp-27蛋白表达明显高于HepG2细胞中的表达,Bel-7402细胞的自我保护功能表现得更为显著,两种细胞的凋亡率度未出现明显差异?结论:EMF照射磁性纳米FeOx颗粒吸附得两种肝肿瘤细胞均能抑制细胞增殖并导致细胞发生大量的早期凋亡,可作为一种潜在的治疗肝脏肿瘤细胞的手段?     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导肝癌细胞凋亡并伴随端粒酶活性下调

目的 :探讨表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)对肝癌细胞凋亡和端粒酶活性的影响。方法 :用MTT法测定EGCG的细胞毒 ,以荧光显微镜、流式细胞仪研究细胞凋亡 ,PCR -ELISA法测定细胞端粒酶活性。结果 :EGCG作用Bel- 74 0 2肝癌细胞后 ,荧光显微镜观察到细胞凋亡现象。在一定时间、一定剂量范围内 ,EGCG诱导细胞凋亡呈现浓度和时间依赖性 ,而端粒酶活性随EGCG诱导Bel - 74 0 2细胞凋亡的发生而逐渐降低。结论 :EGCG可通过下调端粒酶活性诱导BEL - 74 0 2细胞凋亡 ,这可能是茶叶有效成分抗肿瘤的重要机制之一。     

薯蓣皂苷对肝癌细胞Bel-7402和正常人肝细胞LO2增殖和凋亡的影响

目的 研究薯蓣皂苷(dioscin)对肝癌细胞Bel-7402及正常人肝细胞LO2增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 将0.5～16μmol/L薯蓣皂苷干预Bel-7402肝癌细胞和LO2肝细胞24 h,使用MTT法检测细胞增殖抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态变化,Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化...     

bcl—xl和p53在人肝癌Bel7402细胞中的表达及中药的干预作用

目的：从基因水平探讨白花蛇舌草多糖对体外培养的人肝癌Bel7402细胞凋亡诱导的作用及机制。方法：水提醇沉法提取白花蛇舌草多糖，人肝癌Bel7402细胞常规体外细胞培养，设定空白对照组、5-氟尿嘧啶阳性对照组、白花蛇舌草多糖组。HE染色法光镜下观察细胞形态改变，计算凋亡指数，采用MTT法检测白花蛇舌草多糖对癌细胞的生长抑制作用，RT—PCR法检测原癌基因bcl—xl、抑癌基因p53基因mRNA表达的变化。结果：白花蛇舌草多糖体外抑制人肝癌Bel7402细胞生长、促进细胞凋亡，凋亡指数达16．97％，以MTT显色法检测细胞抑制率达到61．5％，以RT—PCR半定量法检测，上调p53基因mRNA表达，降低bcl—xl基因mRNA表达，以上各指标与空白对照组相比均有显著差异。结论：白花蛇舌草多糖抑制人肝癌Bel7402细胞增长，诱导细胞凋亡，其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因bcl—xl基因表达有关。     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

PBMC对B7-2基因修饰的肝癌细胞Bel-7402体外杀伤作用的研究

目的研究B7-2基因修饰肿瘤后对T细胞活化的影响,探索B7-2在肿瘤免疫治疗中的作用。方法构建B7-2基因的表达载体,转染Bel-7402细胞,与外周血单核细胞（PBMC）共孵育,利用流式细胞术（FCM）检测Bel-7402细胞的凋亡。结果 B7-2基因修饰的Bel-7402细胞和PBMC细胞共培养4 h后,凋亡率为12.7%,与对照组（7.5%）比较,细胞凋亡率显著增加（P〈0.01）。结论 B7-2基因修饰能够增强肿瘤细胞对淋巴细胞的活化作用,为基于B7-2的抗肿瘤治疗奠定了基础。     

白杨素敏化rhsTRAIL诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡

目的:研究白杨素(ChR)是否具有增敏重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhsTRAIL)诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡作用。方法:体外培养人肝癌Bel-7402细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)分析细胞死亡率。DNA琼脂糖凝胶电泳确证诱导细胞凋亡作用。Western Bloting检测细胞DR5蛋白的表达。结果:ChR40μmol/L、rhsTRAIL 100ng/mL以及两者合用的细胞死亡率分别为4.91%±0.38%、5.89%±0.39%和28.7%±2.50%。ChR(40μmol/L)联合rhsTRAIL(100ng/mL)处理48小时,人肝癌Bel-7402细胞展示出典型DNA梯形条带图谱。Western Blot分析结果发现:白杨素以浓度和时间依赖的方式上调Bel-7402细胞DR5表达。结论:亚细胞毒性浓度的白杨素具有敏化rhsTRAIL诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡作用。     

Growth inhibition and gene induction in human hepatocellular carcinoma cell exposed to sodium 4-phenylbutanoate

Background Sodium 4-phenylbutanoate （NaPB） can induce cellular differentiation and cell cycle arrest. However, its potential anticancer properties in hepatocellular carcinoma and influence on normal liver cell are still unclear. We observed the effects of NaPB on growth inhibition, including differentiation and phase growth arrest in normal liver cell line L-02 and hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402. Furthermore, we investigated its mechanism in Bel-7402. Methods Hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and normal liver cell line L-02 were treated with NaPB at different concentrations. Light microscopy was used to find morphological change in cells. Cell cycle was detected by flow cytometry. Expression of acetylating histone H4 and of histones deacetylase 4 （HDAC4） were determined by Western blot. The expression of P21WAF1/CIP1 and E-cadherin were observed through immunocytochemistry. Results NaPB treatment led to time dependent growth inhibition in hepatocellular carcinoma cells Bel-7402. NaPB treatment caused a significant decline in the fraction of S phase cells and a significant increase in Go/G1 cells. NaPB increased the expression of P21wAFVCIP1 and E-cadherin in Bel-7402 and significantly decreased the level of HDAC4 in Bel-7402. NaPB significantly improved the level of acetylating histone H4. The normal liver cell line L-02 showed no distinct changes under treatment with NaPB. Conclusions NaPB inhibited the growth of hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and induced partial differentiation through enhancing the acetylating histones. In Bel-7402, the expressions of P21WAF1/CIP1 and E-cadherin may be related to level of acetylating histones and inhibition of cellular growth. NaPB showed no significant effect on normal liver cells.     

佛手柑内酯抑制p62/NF-κB信号轴增强顺铂对肝癌杀伤的影响

目的 观察佛手柑内酯与顺铂联用对肝癌细胞的凋亡及p62/NF-KB信号轴的影响.方法 利用低浓度(1 mol/ L)佛手柑内酯和1 mol/L顺铂联用或单用,处理体外培养的肝癌细胞HepG2和Bel-7402,观察两肝癌细胞的凋亡核形态和Annexin V阳性的凋亡细胞群比例.进一步利用荧光定量聚合酶链反应检测两肝癌细胞的抗凋亡相关基因表达变化,利用荧光素酶报告基因检测NF-kB转录因子的转录活性,利用Western blot法检测细胞内p65及p62的表达水平.结果 低浓度佛手柑内酯与顺铂联用能显著诱导HepG2和 Bel-7402的凋亡核形态和凋亡细胞群比例,两肝癌细胞的凋亡核形态比单用顺铂组分别增加1. 99倍和2. 00倍(P< 0.05),凋亡细胞群比例比单用顺铂组分别增加1.86倍和 2.00倍(P<0.05).低浓度佛手柑内酯与顺铂联用能不同程度降低抗凋亡基因BCL2、BCL2L1、XIAP和BIRC5的表达,并抑制NF-kB转录因子的转录活性和细胞内p65及p62的表达水平.结论 低浓度佛手柑内酯能增强顺铂对肝癌细胞凋亡的诱导,其可能原因与抑制p62/NF-KB信号轴相关.     

蝎毒抗癌多肽对HL-60细胞凋亡及Bcl-2和p53基因表达的影响

目的：研究蝎毒抗癌多肽（APBMV）在体外诱导人急性粒细胞白血病HL-60细胞凋亡的作用及其相关机制。方法采用CCK-8法检测APBMV作用后HL-60细胞的增殖抑制率,光镜观察APBMV作用后HL-60细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测APBMV对相关凋亡基因蛋白表达的影响。结果 CCK-8法显示APBMV能够抑制HL-60细胞增殖,其对HL-60细胞增殖的IC50为15.64μg/ml。流式细胞仪检测提示APBMV能诱导HL-60细胞凋亡,且呈浓度-效应关系。APBMV（16μg/ml）作用48h后,细胞凋亡率为（36.1±2.1）%,与正常对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。Western blot提示APBMV （4、8、12和16μg/ml）组的Bcl-2蛋白表达量分别为正常对照组的78.60%、54.60%、25.50%和4.20%;p53蛋白表达量分别为正常对照组的163.00%、271.00%、355.00%和447.00%。结论 APBMV可有效抑制HL-60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其机制可能与促进HL-60细胞内p53基因的表达,抑制Bcl-2基因的表达有关。