噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒增强子Ⅰ结合蛋白的研究

目的　通过筛选乙型肝炎病毒 (HBV)增强子Ⅰ (Enhl)结合蛋白 ,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法　应用噬菌体展示技术 ,以HBV的增强子Ⅰ的聚合酶链反应 (PCR)产物DNA作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 4轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果　噬菌体经富集后 ,从随机筛选的 12个克隆中得到 6个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV增强子Ⅰ结合的肝细胞蛋白 ,共编码 3种蛋白。分别为 3 磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶、人类血清白蛋白、核膜孔复合体相互作用蛋白。结论　用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV增强子Ⅰ结合的蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,可能是作用于增强子Ⅰ的反式作用因子 ,但它们对HBV增强子Ⅰ是否有转录调控作用还需进行进一步的研究证实。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，探索HCTP4基因的表达调控机制。方法：应用噬菌体表面展示技术，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子．对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物并进行克隆化，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆。成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有：核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8。结论：用噬茵体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究HCTP4的生物学调节机制，进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础。     

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白

目的以乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBV Pre-S2）为靶蛋白，寻找该蛋白相应的结合蛋白。方法应用噬菌体表面展示技术，以纯化的HBV前S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，对筛选克隆进行DNA序列分析，将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索，自GenBank中获得与HBV Pre-S2有结合作用蛋白的cDNA和基因组的全长序列，并用ELISA验证筛选的结合蛋白。结果噬菌体经过5轮生物富集后，将随机筛选的200个噬斑裂解液做PCR，得到120个插入片段长短不一的克隆，ELISA证实获得43个阳性克隆。将其PCR产物序列测定后进行同源搜索，初步确定30个人体肝脏中固有的与乙型肝炎病毒前S2蛋白结合的蛋白，其中含细胞色素P450Ⅰ类A型亚基克隆2个、3个PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白、2个细胞生长抑制蛋白42，1个膜联蛋白All转录变异体、3个转录激活因子5、2个α酸性糖蛋白、5个未知功能蛋白等。结论应用T7 cDNA噬菌体表面展示技术和生物信息学方法筛选并验证了HBV Pre-S2蛋白结合蛋白，为进一步研究Pre-S2蛋白的生物学功能提供新了思路。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的：寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白，进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用，阐明其分子作用机制。方法：应用酵母单杂交体系，以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”，对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选，应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果：共获得了12个双阳性克隆，编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白，其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论：这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合，可能是作用于SPⅠ的反式作用因子，但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用，笔者正进行进一步的研究。     

应用噬菌体展示技术筛选原发性肝癌血清结合蛋白

目的:通过筛选原发性肝癌血清蛋白结合蛋白,探究肝癌的分子发病机制.方法:应用噬菌体展示技术,以肝癌患者的血清作为固相筛选分子,对T7 Select噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的聚合酶链式反应(PCR)扩增后,对阳性PCR产物直接进行序列测定和同源性分析.结果:噬菌体经富集后,随机挑取48个噬斑进行PCR扩增,得到5种大小不同的PCR片断,序列测定后经序列同源性分析,结果发现与肝癌患者血清蛋白结合的蛋白有以下5种:人核仁螺旋体磷酸化蛋白NOLC1,人高度迁移基核小体结合域1(HMGN1),人依赖ATP的DNA连接酶1(LIG1),人小EDRK-丰富因子2(SERF2)和A-kinase anchor protein 9 isoform.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了肝癌血清蛋白结合蛋白,为进一步阐明肝癌的发生及发病机制奠定了基础.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBVPreS2)相互作用的蛋白质基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）技术扩增HBVPreS2基因，连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落，PCR从中扩增出目的片段并测序，进行生物信息学分析。结果 成功克隆出HBVPreS2基因并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在4缺（SD/-Trp-Leu-SAde-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个，其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有12个，细胞色素C氧化酶Ⅱ有1个，细胞色素P450IVF亚基2个，细胞色素C氧化酶Ⅳ亚基同功酶1有2个，人血白蛋白3个，Na^ -K^ ATP的β1亚基1个，前清蛋白2个，植物血凝素半乳糖苷结合亚基1个，未知基因2个，结论 成功克隆出HBVPreS2蛋白的结合蛋白，为进一步研究HBVPreS2的作用提供了新线索。     

噬菌体表面展示技术筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白

目的:通过筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白,为隐源性肝炎的发病机制研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,将隐源性肝炎患者血清作为固相筛选蛋白,用噬菌体正常人肝细胞T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列,然后再探讨该蛋白在隐源性肝炎发病机制中的作用.结果:噬菌体经过5轮生物富集后,从随机筛选的60个克隆中得到24个阳性克隆,经序列测定后进行同源搜索,初步确定人类HCVNS5A转化调节蛋白13(NS5ATP13)为人体肝脏中固有的与隐源性肝炎血清蛋白结合的蛋白.结论:应用T7cDNA噬菌体表面展示技术,我们发现隐源性肝炎血清蛋白与人类肝细胞HCVNS5A转化调节蛋白13相互作用,在隐源性肝炎发生及抗病毒治疗有重要意义.     

噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β蛋白结合蛋白

目的:利用噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β(IFN-β)肝细胞结合蛋白,探讨IFN-β抗病毒的分子生物学机制.方法:应用噬菌体展示技术,以重组的IFN-β蛋白包被酶联免疫板,作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程.经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析.结果:对肝细胞cDNA文库经过5轮的生物淘洗,从最后一轮筛选的顶层琼脂中随机挑选40个克隆,构建克隆载体,序列测定后经过同源性搜索和生物信息学分析,确定了和IFN-β蛋白具有结合作用的肝细胞蛋白.结论:筛选到与IFN-β蛋白具有结合作用的多种具有不同生理、生化功能的肝细胞蛋白.     

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活基因HCTP4基因序列表达的调控机制。方法：选取翻译起始密码子ATG上游44l bp的DNA序列为启动子序列，应用聚合酶链反应技术(PCR)，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-HCTP4-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-HCTP4-promoter能够指导CAT的表达，吸光度(A值)是pCAT3对照质粒的5倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性，这一结果为研究HCTP4的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒核心蛋白的作用机制奠定了基础。     

ATM-Dependent Phosphorylation of Hepatitis B Core Protein in Response to Genotoxic Stress

Chronic hepatitis caused by infection with the Hepatitis B virus is a life-threatening condition. In fact, 1 million people die annually due to liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Recently, several studies demonstrated a molecular connection between the host DNA damage response (DDR) pathway and HBV replication and reactivation. Here, we investigated the role of Ataxia-telangiectasia-mutated (ATM) and Ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) PI3-kinases in phosphorylation of the HBV core protein (HBc). We determined that treatment of HBc-expressing hepatocytes with genotoxic agents, e.g., etoposide or hydrogen peroxide, activated the host ATM-Chk2 pathway, as determined by increased phosphorylation of ATM at Ser1981 and Chk2 at Thr68. The activation of ATM led, in turn, to increased phosphorylation of cytoplasmic HBc at serine-glutamine (SQ) motifs located in its C-terminal domain. Conversely, down-regulation of ATM using ATM-specific siRNAs or inhibitor effectively reduced etoposide-induced HBc phosphorylation. Detailed mutation analysis of S-to-A HBc mutants revealed that S170 (S168 in a 183-aa HBc variant) is the primary site targeted by ATM-regulated phosphorylation. Interestingly, mutation of two major phosphorylation sites involving serines at positions 157 and 164 (S155 and S162 in a 183-aa HBc variant) resulted in decreased etoposide-induced phosphorylation, suggesting that the priming phosphorylation at these serine-proline (SP) sites is vital for efficient phosphorylation of SQ motifs. Notably, the mutation of S172 (S170 in a 183-aa HBc variant) had the opposite effect and resulted in massively up-regulated phosphorylation of HBc, particularly at S170. Etoposide treatment of HBV infected HepG2-NTCP cells led to increased levels of secreted HBe antigen and intracellular HBc protein. Together, our studies identified HBc as a substrate for ATM-mediated phosphorylation and mapped the phosphorylation sites. The increased expression of HBc and HBe antigens in response to genotoxic stress supports the idea that the ATM pathway may provide growth advantage to the replicating virus.     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析

目的：利用酵母双杂交技术，业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因。为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性，阐明HCBP6的生物学功能，我们应用生物信息学技术，克隆猴HCBP6同源基因序列，并对其结构进行分析。方法：应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照，对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析。对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较。结果：猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570bp，编码产物HCBP6蛋白由189aa组成。猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96．27％、89．95％、85．7l％。结论：生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径。猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础。     

Binding of Nanoparticles Harboring Recombinant Large Surface Protein of Hepatitis B Virus to Scavenger Receptor Class B Type 1

(1) Background: As nanoparticles containing the hepatitis B virus (HBV) large (L) surface protein produced in yeast are expected to be useful as a carrier for targeting hepatocytes, they are also referred to as bio-nanocapsules (BNCs). However, a definitive cell membrane receptor for BNC binding has not yet been identified. (2) Methods: By utilizing fluorescence-labeled BNCs, we examined BNC binding to the scavenger receptor class B type 1 (SR-B1) expressed in HEK293T cells. (3) Results: Analyses employing SR-B1 siRNA and expression of SR-B1 fused with a green fluorescent protein (SR-B1-GFP) indicated that BNCs bind to SR-B1. As mutagenesis induced in the SR-B1 extracellular domain abrogates or attenuates BNC binding and endocytosis via SR-B1 in HEK293T cells, it was suggested that the ligand-binding site of SR-B1 is similar or close among high-density lipoprotein (HDL), silica, liposomes, and BNCs. On the other hand, L protein was suggested to attenuate an interaction between phospholipids and SR-B1. (4) Conclusions: SR-B1 can function as a receptor for binding and endocytosis of BNCs in HEK293T cells. Being expressed various types of cells, it is suggested that functions as a receptor for BNCs not only in HEK293T cells but also in other types of cells.