原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

HBx-DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲⅠ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情况。结果显示，７５％（３３／４４）的肝癌ＤＮＡ中有ＨＢＶ－ＤＮＡ存在，其中，以纯整合型方式存在的为６３．６％（２１／３３），混合型为３６．４％（１２／３３），无游离型。纯整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ片段中，ＨＢｘ－ＤＮＡ阳性率为９０．５％（１９／２１）。提示ＨＢＶ在肝细胞性肝癌的发生中起着重要的作用，ＨＢＶ－ＤＮＡ可能以片段性整合的方式存在于肝癌细胞染色体上，其中以ＨＢｘ基因的整合为主。     

原发性肝癌中HBV X,S,Pre—S,C基因片段整合与ras,myc癌基因 …

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶ ＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶ Ｘ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶ Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、     

HBx—DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ Ⅱ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘ ＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情     

原发性肝细胞癌p53基因突变检测

为了解在黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）低含量区以ＨＢＶ为主要危险因素的ＨＣＣｐ５３基因突变情况，并分析它与ＨＢＶ及其它因素的关系，作者筛检了成都地区３２例原发性肝癌（ＨＣＣ），分别应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰＳｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交及免疫组化染色法检测了３２例ＨＣＣ及２７份癌旁肝组织中ｐ５３基因突变、ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达。结果：所有ＨＣＣ病例均感染过ＨＢＶ，肝癌细胞中ＨＢＶＤＮＡ整合率７１．９％，癌旁组织均有肝硬化或／和慢活肝病变，且ＨＢｓＡｇ表达率９６．３％。３２例ＨＣＣ中检出８例Ｐ５３蛋白阳性（２５％），这种改变与ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达无明显关系，而与ＨＣＣ发生年龄有关；３２例ＨＣＣ组织中有２例ｐ５３基因第２４９号编码子突变（６．２５％），明显低于ＡＦＢ１高含量区ＨＣＣ，而与台湾、日本等ＡＦＢ１低含量区报道一致，提示：成都地区ＨＣＣ与ＨＢＶ感染确有密切关系；ｐ５３改变在ＨＣＣ发生上有一定作用，但是多数ＨＣＣ并无ｐ５３基因突变又提示ＨＣＣ发生尚涉及其它复杂机制；ＨＢＶ在ＨＣＣｐ５３基因改变中的作用机制值得进一步探索。     

原发性肝细胞癌p53基因突变检测

为了解在黄曲霉毒素Ｂ１低含量区以ＨＢＶ为主要危险因素的ＨＣＣｐ５３基因突变情况，并分析它与ＨＢＶ及其它因素的关系，作者筛检了成都地区３２例原发性肝癌，分别应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交及免疫组化染色法检测了３２例ＨＣＣ及２７份癌旁肝组织中ｐ５３基因突变、ＨＢＶ ＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达，结果：所有ＨＣＣ病例均感染过ＨＢＶ，肝癌细胞中ＨＢＶ ＤＮＡ整合率７１．９％，癌旁组织均有肝硬     

人原发性肝细胞癌地高辛素标记HBV DNA探针的原位杂交与C－myc和P_（53）癌基因表达相互关系的研究

取自肝癌高发区的４０例人原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）标本，应用地高辛素（Ｄｉｇ）标记ＨＢＶＤＮＡ探针作原位杂交，检测ＰＨＣ和癌周肝组织内ＨＢＶＤＮＡ的表达，并用光敏生物素Ｃ－ｍｙｃ癌基因探针原位杂交和用免疫组化检测ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ及Ｐ５３癌基因在ＰＨＣ和癌周肝组织内的表达。Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针肝内总阳性率为８０％，在ＰＨＣ内为６５％，而癌周肝组织中为７３％。ＨＢＶ－ＤＮＡ定位于肝细胞或癌细胞的胞浆和胞核内，而ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒在胞浆内比胞核内多。ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞癌周比癌内更多。结果表明，ＰＨＣ病例与ＨＢＶ存在关系密切；癌内ＨＢＶＤＮＡ大都属整合型，而癌周属游离型。研讨ＰＨＣ内ＨＢＶＤＮＡ的表达与ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ，和Ｐ５３及Ｃ－ｍｙｃ癌基因的表达相互关系及致癌作用。     

乙型肝炎病毒基因组中p53应答成分结合序列的确定及意义

目的：探讨ＨＢＶ与肿瘤抑制基因ｐ５３相互作用的机制及其在原发性肝癌发生中的意义．方法：应用计算机程序对ＨＢＶ全基因组进行比较分析，合成含ＤＮＡ－蛋白质结合位点的基因片段作为探针，与肝癌细胞核蛋白作用．通过凝胶电泳移动试验，凝胶电泳超移动试验，原位紫外线交联试验，确定ＨＢＶ与ｐ５３蛋白的特异性结合．应用带报道基因ＣＡＴ与ｐ５３，ＨＢＶＸ基因共转染，观察ＨＢＶ与ｐ５３蛋白相互作用的生物学功能．结果：ＨＢＶ基因组增强子Ｉ上游区域（１０４７～１０５９）存在ｐ５３基因应答成份结合位点序列，能特异性地与ｐ５３蛋白结合，使ｐ５３蛋白在细胞内积聚．结论：ＨＢＶ与ｐ５３存在ＤＮＡ－蛋白质结合关系，在ＨＢＶ感染相关的肝癌发生中具有非常重要的理论意义．     

整合型HBV—DNA前C区基因突变与肝细胞癌的相关性

１．目的 探讨整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ前Ｃ区基因突变与肝细胞癌的关系。２．方法应用聚合酶链反应单链构象多态技术,对２９例肝癌１２例慢性肝硬化和１４例非肝病病伯肝组织内整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ前Ｃ区进行突变分析。３．结果 肝癌、肝硬化和正常肝组织中整型ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为９６．５５％,６６．６７％和１４．２９％,组间比较差异有显著性（ｘ＾２＝２９．４３,Ｐ〈０．００１）,３组整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ前Ｃ区     

聚合酶链反应检测HBV─DNA及临床意义的再认识

采用聚合酶链反应检测１１４例肝病患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果：１１４例患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率３５．９６％，其中ＡＨ、ＣＰＨ、ＣＡＮ、ＬＣ组ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为４１．６７％、２１．４３％、５３．６６％和２６．３１％；ＨＢｅＡｇ（＋）组３９．０２％，抗ＨＢｃ（＋）组２２．７３％，ＨＢｓＡｇ（＋）、抗ＨＢｃ（＋）组４３．３７％，抗ＨＢｓ（＋）组４１．１８％；ＨＢＶＭ（－）组１１．１１％。结果提示：①ＣＡＨ组阳性率较高（５３．６６％）；②抗ＨＢｅ（＋）患者血清中有高滴度ＨＢＶ－ＤＮＡ，提示仍有传染性；③抗ＨＢｅ（＋）、抗ＨＢｓ（＋）、ＨＢＶＭ（－）的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性可能为ＨＢＶ的变异株感染。     

肝癌的病毒病因学研究

为了探讨了乙型肝炎病毒（ＨＢＶ），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染与肝细胞肝癌（ＨＣＣ）发生的关系及原癌基因ｒａｓ和肿瘤抑制基因ｐ５３在肝癌中的变化，我们利用免疫组人技术检测了福尔马林固定，石蜡包埋理肝癌组织内乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ），核心抗原（ＨＢｓＡｇ）的表达以及ｒａｓＰ２１，ｐ５３蛋白的过量表达，利用聚合物聚链式反应（ＰＣＲ）检测了肝癌及癌旁组织的ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。在２５例外检     

重庆地区HBV、HCV感染的肝癌组织中癌基因与抑癌基因的表达

提示重庆地区肝癌患者ＨＢＶ和／或ＨＣＶ的感染与癌组织中癌基因和抑癌基因表达之间的联系。方法：应用免疫组织化学方法检测ＨＢＶ和ＨＣＶ抗原以诊断ＨＢＶ和ＨＣＶ感染,癌基因ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｅｒｂＢ－２和抑癌基因Ｐ５３蛋白的表达也用免疫 经方法检测。结果４６例肝癌患者中,ＨＢＶ感染３４例,ＨＣＶ感染２０例;其癌组织中ｒａｓ ｐ２１、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｅｒｂＢ－２和Ｐ５３蛋白表达阳性率分别为５８．７％     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体的制备及肝癌组织中相应抗原的检测

应用基因工程技术制备的１７０００乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ蛋白（ＨＢｘＡｇ）免疫动物，成功地制备了抗－ＨＢｘ单克降抗体，以此抗体对原发性肝癌（ＨＣＣ）组织、慢性活动性肝炎（ＣＡＮ）肝组织行相应抗原检测，并同时进行乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）的检测。在ＨＣＣ标本中ＨＢｘＡｇ在癌内及癌周肝组织中的阳性率分别为５６％及４８％，ＨＢｓＡｇ为１６％及７４％。ＨＢｃＡｇ仅见于癌周，阳性率为１８％。在ＣＡＨ标本中，ＨＢｘＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ阳性率分别为６．６％、７３．３％及０。血清ＨＢｓＡｇ阳性ＨＣＣ标本中，ＨＢｘＡｇ的检出率为８２．３％、明显高于血清ＨＢｓＡｇ阴性标本（５４．５％）。结果显示。ＨＢｘＡｇ在ＨＣＣ标本中的表达是ＨＢＶ标志物中最活跃的。ＨＢｘＡｇ的表达不依赖于ＨＢＶ的复制，可能是ＨＢＶＸ基因同宿主细胞基因整合后的产物，ＨＢｘＡｇ在ＨＣＣ标本中的活跃表达为抗－ＨＢｘ抗体作为ＨＣＣ导向治疗载体提供了依据。     

HBV亚基因整合及其致癌性研究

探讨乙型肝炎病毒亚基因在肝细胞癌发生中的作用。方法 以ＢａｍＨ，Ｉ，ＢｇｌⅡ酶切３．２ｋｂ ＨＢＶ ＤＮＡ，回收其ＨＢｓ，ＨＢｘ，ＨＢｃ，ＰｒｅＳ亚基因片段，以地高辛甙元标记成探针。以ＨＢＶ探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析其存在状态，以ＨＢＶ亚基因探针Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交亚基因转录。     

地高辛标记探针原位杂交对肝细胞癌HBV DNA分布的研究

为了探讨ＨＢＶ与肝细胞癌（ＨＣＣ）发病的关系，作者应用地高辛标记ＨＢＶ ＤＮＡ探针原位杂交及免疫组化检测了８０例ＨＣＣ组织及癌周肝组织的ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ。结果显示，癌周肝组织ＨＢＶ阳性６３例（７９％），癌组织ＨＢＶ阳性４９例（６０％），癌周阳性细胞数明显多于癌内。癌周ＨＢＶ ＤＮＡ，以复制型为主，而癌组织的ＨＢＶ ＤＮＡ大多属整合型。结果表明大多数ＨＣＣ病例与ＨＢＶ存在密切相关，而且整合     

血清、白细胞HBV－DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＮＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

地高辛标记DHBVDNA探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛标记含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）基因片段的质粒ＰＢＲ３２２作为探针，建立ＤＨＢＶＤＮＡ斑点杂交试验，结果：探针可检出１．０ｐｇ同源ＤＮＡ片段，不与人乙肝病毒（ＨＢＶ）及鸭肝细胞ＤＮＡ发生杂交，与￣３５Ｓ－ＤＨＢＶＤＮＡ探针的灵敏度相似。该探针检出重庆地区２－３月龄麻鸭血清ＤＨＢＶ自然感染率为２５．４８％；用ＤＨＢＶ血清经腹腔感染１－２日龄雏鸭，１周后阳性感染率为８２．９０％，并可持续感染至少２月。     

HCV对HBV干扰作用的研究

应用ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ技术，分析ＨＣＶ ＲＮＡ阳性及阴性标本的ＨＢＶ ＤＮＡ及ＨＢｓＡｇ的感染状况，以探讨ＨＣＶ对ＨＢＶ的干扰作用。结果发现当ＨＢｓＡｇ阳性时，无论ＨＣＶ ＲＮＡ是否阳性，ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性率分别为５３．８５％和５９．０９％无明显差异，（Ｐ〉０．０５）；当ＨＢＶ ＤＮＡ阳性时，两驵ＨＢｓＡｇ的转阴率分别为３３．３３％和２３．５３％，无明显差异，（Ｐ〉０．０５）。实验表明ＨＣＶＣＦ     

非小细胞肺癌ras—p21蛋白表达与细胞DNA倍体的关系

目的：分析非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中ｒａｓ－ｐ２１蛋白表达与细胞ＤＮＡ含量和增殖活性的关系。方法：用ＡＢＣ免疫组织化学方法研究ｒａｓ－ｐ２１蛋白在３０例ＮＳＣＬＣ中的表达，以超过２０％的癌细胞着色为阳性。用流式细胞术检测细胞ＤＮＡ含量并计算增殖指数。结果：２３例异倍体和７例二倍体ＮＳＣＬＣｒａｓ－ｐ２１蛋白表达的阳性率无明显差别（６５．２％对８５．７％，Ｐ＝０．３０）。２１例ｒａｓ－ｐ２１蛋白表达阳性和９例阴性的ＮＳＣＬＣ，其增殖指数无明显差别，［（２４．５５±５．８７）％对（２３．３２±４．６８）％，Ｐ＝０．５９］。结论：ｒａｓ－ｐ２１蛋白表达与ＮＳＣＬＣ细胞ＤＮＡ含量和增殖活性无关，而与细胞的终末分化有关。