脐血和合并乙型肝炎病毒感染肝癌患者来源CIK细胞的增殖及杀伤活性

目的：观察脐血和乙型肝炎病毒感染肝癌患者外周血诱导的CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性的特点。方法： 分别采集解放军第105医院妇产科住院的健康产妇剖宫产胎儿的脐带血5份（A组）、感染科住院的合并乙型肝炎病毒感染的原发性肝癌患者自体外周血15份（B组）、无乙型肝炎病毒感染的原发性肝癌患者自体外周血5份（C组）,采用Ficoll两步分离法分离出单个核细胞,细胞因子诱导培养成细胞因子诱导的杀伤(ClK)细胞,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型CD3＼CD8＼CD16＼CD56,MIT法测定其对白血病K562细胞的杀伤活性。结果：体外培养15 d时, C组CIK细胞体外增殖倍数与A组相似\[（577.24±202.4）vs（600.93±249.1）倍, P >0.05\],该两组均显著高于B组\[（385.16±117.3）倍, P <0.05\];A组CIK细胞杀伤活性显著高于B组和C组\[（77.3±5.1）% vs （44.1±3.4）%、（54.5±3.7）%, P <0.01\]。结论： 脐血来源的CIK细胞体外增殖快、杀伤活性强;合并有乙型肝炎病毒感染的肝癌患者CIK细胞体外增殖能力和杀伤能力明显降低,不宜接受自体CIK细胞移植。     

脐带血和乳腺癌患者外周血来源CIK细胞PD-1表达及对MCF-7细胞杀伤

目的：探讨脐带血和乳腺癌患者外周静脉血来源的CIK细胞程序性死亡分子-1（programmed cell death-1,PD-1）的表达及其对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用。方法: 采集2015年6月至2015年12月在解放军第105医院住院的健康产妇脐带血和乳腺癌患者外周静脉血各5例,分离PBMC,体外培养、扩增CIK细胞。流式细胞术检测不同时间节点两种来源的CIK细胞PD-1表达情况,分别取培养第7、14、21、28天的CIK细胞与MCF-7细胞共培养,细胞计数（CCK-8）法测定CIK细胞对MCF-7细胞的杀伤率, 吖啶橙-溴化乙啶双染(AOEB)法观察共培养后CIK细胞凋亡变化,流式细胞术检测CIK细胞凋亡率。结果: 随着体外培养时间的延长,脐带血和乳腺癌患者静脉血来源的CIK细胞PD-1表达率均逐渐上升,第14天时脐带血组CIK细胞PD-1表达率低于乳腺癌组\[（38.42±4.76）% vs （50.54±3.50）%,P<0.05\],至第21天后两组PD-1表达率均升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。培养第7、14、21、28天两组CIK细胞对MCF-7细胞的杀伤率分别为(18.54±354）%和（21.74±427）%、（71.86±16.86）% 和（58.78±24.25）%、（44.32±26.87）%和（43.96±26.04）%、（43.24± 24.27）%和（40.28±23.69）%,以培养第14天的脐带血来源的CIK细胞的杀伤活性最强（P<0.05）。分析发现,两种来源的CIK细胞PD-1表达水平与CIK细胞的凋亡率呈正相关(r=0.971,r=0.900, 均P<0.01）,与杀伤率呈负相关（r=-0.865,r=-0885, 均P<0.01）。结论: 活化的CIK细胞表面高表达PD-1,脐带血较乳腺癌患者静脉血来源的CIK细胞表面PD-1水平低;培养第14天的CIK细胞凋亡率均较低,其杀伤能力更强。     

来源于未缓解白血病患者的DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤活性

目的：体外诱导培养缓解期及未缓解期急性白血病患者来源的树突状细胞（dendritic cell, DC)联合细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer, CIK)细胞,比较两者的增殖能力、免疫表型及对白血病细胞的杀伤活性。方法: 提取2013年4月25日至2014年1月17日河北医科大学第二医院血液科收治的复发难治未缓解期白血病患者（7例）和缓解期患者（7例）的外周血单个核细胞,分别按常规方法诱导产生DC-CIK细胞,在培养过程中检测细胞增殖倍数,流式细胞术检测CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例,细胞涂片法和流式细胞术检测培养前后CD34+白血病细胞比例,CCK-8法检测两组DC-CIK细胞对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤活性。结果: 缓解组和未缓解组来源的DC-CIK细胞均以相似的速度快速增殖,CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例均随培养时间延长显著升高（ P <0.05）,但两组间差异没有统计学意义（ P >0.05）。培养第15天时,非缓解组DC-CIK细胞涂片检测未见CD34+原始白血病细胞,流式细胞术检测显示CD34+细胞比例较培养前显著降低\[（0.1±0.05）% vs (8.3±3.1)%, P <0.05\]。效靶比在5 ∶1~20 ∶1范围内时,缓解组与未缓解组DC-CIK细胞对K562细胞的杀伤率差异没有统计学意义（ P >0.05）,但未缓解组DC-CIK对患者单个核细胞的杀伤率显著高于缓解组（ P <0.05）,并且显著高于未缓解组对K562细胞的杀伤率（ P <0.05）。结论:未缓解期白血病患者来源的DC-CIK细胞在增殖活性、CD3+CD8+和CD3+CD56+表达水平和对K562细胞的非特异性杀伤活性方面与缓解期患者来源的DC-CIK细胞均相似,但对患者单个核细胞的杀伤具有更强的特异性。     

DC与CIK共培养后对白血病细胞杀伤活性的研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性、表型的变化,及其对K562、HL-60白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC),置于37℃,5%CO2培养箱培养2 h,收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导分化出成熟DC,将成熟DC和CIK细胞按1 5的比例混合培养3天,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤K562和HL-60白血病细胞株的活性。结果DC-CIK共培养后增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P<0.05);培养第14天,CIK中CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比率分别为58.6%±7.3和26.5%±6.2,DC-CIK的CD3+CD8+、CD3+CD56+的比率分别为72.5%±4.2和38.4%±6.1,表达差异显著(P<0.05);在2.5∶1~20∶1的效靶比范围内,DC-CIK对K562、HL-60细胞的杀伤活性较单纯CIK细胞组的杀伤活性要高(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞是增殖活性和细胞毒活性均高于CIK细胞的免疫活性细胞。     

白细胞介素-27促进CIK细胞的增殖及其对淋巴瘤细胞的杀伤能力

目的： 初步探讨重组人白介素-27（interleukin-27, IL-27）体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖及其对肿瘤细胞的杀伤能力的影响。 方法:无菌条件下分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,第0天加入IFN-γ、CD3单抗,之后根据加入不同细胞因子剂量随机分为六组进行CIK细胞培养：A组（IL-2：1 000 U/ml,正常对照组）, B组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：20 ng/ml）, C组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：10 ng/ml）, D组（IL-2：500 U/ml,IL-27：10 ng/ml）,E组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：5 ng/ml）, F组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：40 ng/ml）。倒置相差显微镜下观察各组CIK细胞生长情况,流式细胞术检测各组CIK细胞CD3 +CD56 +T、CD8 +T细胞的表达,自动细胞计数仪计数各组CIK细胞增殖情况,MTS方法测定各组CIK细胞对淋巴瘤K562细胞的杀伤活性。 结果： 培养第11天,D组与A、B、C组比较,CIK细胞中CD3 +CD56 +T细胞的表达\[（6657±244）% vs（6003±175）%,（5551±003）%,（5607±083）%;均P<005\]、CD8 +T细胞的表达\[（8167±197）%  vs（7030±267）%,（7492±247）%,（7443±190）%;均P<005\]都明显增强;D组CIK细胞培养的扩增倍数明显高于A、B、C组\[（4 81187±2307)  vs  (3 25773±9197), (379092±6449), (4 00985±4308)倍;均P<005\];效靶比40 ∶1时; D组CIK细胞培养第11天时杀伤力为（7671±221）%,显著高于其他各组（均P<005）。 结论： 细胞因子IL-27体外可显著提高CIK细胞的增殖能力和杀伤能力,最佳培养周期为11 d。     

ATG-F培养体系制备CIK细胞的表型特点及其对K562细胞的杀伤作用

目的：探讨抗人T细胞兔免疫球蛋白-费森尤斯（anti-human T lymphocyte rabbit immunoglobulin-Fresenius,ATG-F）和IFN-γ、IL-2 组成的培养体系诱导细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞的性能并用于临床细胞治疗的可行性。方法:采集分离健康供者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),依照激活抗体的不同分组分别培养CIK细胞,在第7 和14 天计数总细胞数量。流式细胞术检测ATG-F组、CD3 组和TG（抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白,Thymoglobulin）组CIK细胞组成及细胞表面活化性、抑制性受体分子的比例,还检测第14 天时ATG-F高剂量组、CD3 组和TG组CIK细胞对K562 靶细胞的杀伤性能。结果：使用ATG-F、IFN-γ、IL-2 培养体系成功诱导出CIK细胞。第14 天时高剂量ATG-F（F-H）组增殖倍数明显高于TG组（27.25±1.25 vs 16.60±1.72,P<0.01）;其CD3+CD56+细胞比例与CD3 组无统计学差异(P<0.05）,但CD3-CD56+的NK细胞显著高于TG 组及CD3 组[ （11.19±2.60）% vs（5.66±1.00）%、（1.42±0.51）,P<0.01]、CD4+T 细胞比例显著低于CD3、TG 组[（4.35±1.47）% vs（26.88±5.01）%、（14.52±6.22）%,P<0.01]、CD56+CD94+ 、CD56+CD158a+ 、CD56+CD158b 细胞比例均明显高于CD3 组（ 均P<0.01）;F-H 组在靶效比为1∶10 时对K562 的杀伤效力显著高于CD3 组[ （60.52±2.05）% vs（30.02±6.67）%,P<0.01]。结论：ATG-F培养体系制备的CIK 细胞比常规培养体系所得CIK 细胞具有更高的NK细胞比例,其活化受体对K562细胞更强的细胞毒性。     

PersonGen TM 技术和CIK细胞培养方法对T细胞扩增与活化效果的比较

目的： 探讨基于第一/第二刺激信号原理联合IL-15的的T淋巴细胞扩增技术（PersonGen TM ）和细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞培养扩增方案对T细胞扩增和活化的效果。方法：分离8名健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,分别采用CIK细胞扩增技术（CIK组）、PersonGen TM 扩增技术（PersonGen TM 组）及两种技术的联合应用（C＋P组）刺激PBMC增殖,应用细胞计数法和流式细胞术比较T细胞的扩增效率及T细胞亚群比例,并以人白血病K562细胞及骨髓瘤RPMI 8226细胞为靶细胞检测扩增后T细胞的杀伤活性。结果：经过3周培养后,CIK、PersonGen TM 和C+P 3组T细胞扩增倍数分别为（254±56）、（863±218）和（793.3±395）倍。其中CD3 +细胞所占比例分别为（51.61±14.95）%、（99.21±0.79）%和（96.14±5.16）%; CD3 +CD4 +在CIK组细胞扩增了近5倍,C＋P组与PersonGen TM 组均扩增近160倍;CD3 +CD8 +细胞在CIK组扩增了近500倍,C＋P组和PersonGen TM 组扩增达千倍;CD3 +CD56 + NKT细胞在CIK组扩增700多倍,其他两组达千倍。杀伤实验结果显示,当E∶T为5∶1时,3组细胞对K562杀伤率为（45.53±19.16）%、（36.53±10.6）%和（53.17±5.83）%,对RPMI 8226杀伤率为（41.23±12.5）%、（38.83±4.3）%和（45.73±7.48）%。结论： Person Gen TM 扩增技术获得的T细胞数量多、纯度高,其中CD3 +CD8 +和CD3 +CD56 + NKT细胞比例较高,其对K562和RPMI 8226肿瘤细胞的杀伤效果相似于CIK细胞扩增方案获得的T细胞。     

自体来源树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞混合培养对原代乳腺癌细胞的杀伤作用

 目的　探讨原代乳腺癌细胞冻融抗原负荷自体来源树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞混合培养后对原代乳腺癌细胞杀伤活性的影响作用。方法　取对数生长期的原代乳腺癌细胞制备肿瘤抗原（Ag）,用自体外周血单个核细胞分别制备DC 和CIK细胞;用负荷Ag的DC 和CIK细胞共培养,诱导Ag-DC-CIK细胞。采用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测分离的单个核细胞（CBMC）、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对原代乳腺癌细胞的杀伤活性。结果　外周血CBMC、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对乳腺癌原代肿瘤细胞杀伤活性分别是（34.35±3.28）%、（45.91±2.78）%、（50.88±3.22）%、（62.10±5.94）%,实验组细胞（Ag-DC-CIK）对原代乳腺癌细胞的杀伤能力（62.10±5.94）%明显高于对照组（P＜0.01）。结论　肿瘤抗原负荷的DC 能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为DC 的免疫治疗提供了新的思路。     

自体DC-CIK细胞治疗晚期肾细胞癌的疗效

目的：探讨自体树突状细胞（dendritic cell,DC）激活的细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞在晚期肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）治疗中的临床效果与安全性。方法：采集22例2011年7月至2012年6月期间南京医科大学附属苏州医院肿瘤内科收治的22例RCC Ⅳ期患者\[男性12例、女性10例,中位年龄60.8岁（21~79岁）\]外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,体外制备成DC-CIK细胞。流式细胞术分析DC-CIK细胞中CD3+T、CD8+T、CD4+T、NK（CD3-CD56+）和NKT（CD3+CD56+）细胞的比例,MTT法检测DC-CIK细胞对白血病K562细胞（对NK细胞敏感）和肾癌786-0细胞（对NK细胞不敏感）的杀伤活性。受试患者于常规治疗（手术+化疗+放疗/细胞因子治疗）结束后4周进行DC-CIK细胞治疗,每次静脉回输细胞数约（5.0±0.5）×108个,5次为1疗程,共3个疗程,分别于疗程开始前与结束后1周内监测患者外周免疫学指标（淋巴亚群、细胞因子谱）,严密观察并记录治疗过程中的不良反应。结果：DC-CIK细胞组成为CD3+细胞占（86.92±5.32）%、CD3+CD8+CD56+（NKT细胞）占（52.04±7.33）%、CD8-CD56+（NK细胞）占（785±315）%,DC-CIK细胞对786-0细胞和K562细胞的体外杀伤率相仿（效靶比为3∶1时,杀伤率分别为（16.5±1.7）%和（18.4±1.9）%,P=0.014）。患者接受DC-CIK细胞治疗后,外周血淋巴细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD3-CD56+NK细胞）比例无显著变化（P>0.05）;外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ细胞因子水平较治疗前明显提升（均P＜0.05）,而TNF-α 和IL-10变化不明显（均P＞0.05）。2例患者发生一过性发热,持续4~6 h恢复,1例出现短期乏力。结论：DC-CIK细胞体外能有效杀伤786-0细胞和K562细胞。 输注后可提升部分RCC患者免疫水平,安全性良好,可作为晚期RCC患者辅助治疗之一。     

脐带血单个核细胞体外诱导成CIK细胞及其抗肿瘤效应的实验研究

目的:探索建立CIK细胞的原代培养方 法并阐明其生物学特性,为该细胞在肿瘤生物过 继免疫治疗中的运用奠定基础。方法:通过加入 4种细胞因子(IFN γ、IL 2、IL 1及OKT3)将脐带 血单个核细胞(CBMNCs)诱导成CIK细胞;利用 流式细胞仪测定细胞表型、细胞增殖情况及细胞 周期的分布;利用改良的MTT法测定效应细胞 的体外细胞毒活性。结果:四种细胞因子的联合 运用,可诱导出大量的CIK细胞,其相对百分率 增长了163倍(从0.14%到22%),增殖高峰位 于第10～12天,针对K562、Hela和YTMLC肿瘤 细胞株,CIK细胞在效靶比为64∶1时的杀伤活 性分别为78.57±3.48、77.7±1.90和81.2± 1.51,在32∶1时分别为62.00±2.31、60.83± 2.80和64.07±2.87,在16∶1时分别为51.43± 2.51、52.87±2.91和54.10±3.11,均显著高于 LAK细胞及CBMNCs,P=0.001;而在效靶比为 8∶1(25.10±2.66、21.4±1.55和28.77±3.56) 及4∶1(17.10±2.10、11.93±1.86和9.49±2.92) 时与后两者差异无统计学意义,P=0.083。结 论:1)脐带血可作为诱导CIK细胞的重要来源 2)联合运用细胞因子能诱导出大量的CIK细胞 其增殖高峰位于培养的第12天,适宜在此期进 行临床运用;3)CIK细胞较LAK细     

丙戊酸钠对CIK细胞杀伤K562细胞活性的影响

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞杀伤K562细胞活性的影响.方法 通过半定量RT.PCR、流式细胞术等方法 检测经VPA诱导的K562细胞MICA的mRNA和蛋白表达情况.MTT法检测CIK细胞对经VPA诱导的K562细胞的杀伤活性.结果 经VPA诱导的K562细胞的MICA-mRNA、细胞膜MICA表达增加;CIK细胞对经VPA诱导的K562细胞的杀伤活性增加,杀伤活性与K562细胞膜MICA表达呈正相关.结论 VPA可以上调K562细胞MICA的表达,进而增加其被CIK细胞杀伤的敏感性.     

DCIK细胞治疗急性髓细胞性白血病的疗效观察

摘 要　目的: 评价DCIK细胞过继免疫治疗急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）的临床疗效。方法：选取苏州大学附属第一医院2006年1月至2007年12月所收治的10例确诊AML患者，经常规化疗后处于完全缓解中，经院伦理委员会批准和患者知情同意，用血细胞分析仪分离外周血中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在体外诱导培养成DCIK细胞；以流式细胞术检测DCIK细胞的表型，以MTT法检测DCIK细胞对人红白血病细胞K562的杀伤活性，确认质量合格后回输给患者进行抗肿瘤免疫治疗；治疗后评价其近期临床疗效、免疫学活性及不良反应等。结果：体外成功诱导培养DCIK细胞，其对白血病细胞株K562的杀伤率为(58.3±3.3)%；DCIK细胞群中，CD3+CD56+ 占(38.4±9.42)%。10例患者经治疗后，7例持续完全缓解（continuous complete remission，CCR），占70%；患者回输DCIK后外周血中的CD4+ 、CD8+ 、CD56+ 的比例均有明显提高(P<0.05或P<0.01)；无一患者出现严重不良反应。结论：DCIK能诱导机体产生特异性的免疫反应，对急性髓细胞性白血病的治疗有较好的临床疗效。     

体外培养不同时间后冻存对脐血来源CIK细胞生物学活性的影响

目的： 观察体外培养不同时间后冻存对人脐血来源细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖、免疫表型、细胞毒活性以及细胞因子分泌的影响。 方法： CIK细胞在体外培养6 、9 、12 d后冻存1个月,复苏后培养至72 h,其间每隔24 h检测细胞增殖情况,并采用流式细胞术检测复苏后细胞免疫表型、CCK-8法检测复苏后细胞对A549细胞的杀伤活性、ELISA方法检测复苏后CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的变化。 结果： 体外培养不同时间后冻存的CIK细胞在复苏后仍然显示出较好的增殖活性,其中,体外培养6 d后冻存组CIK细胞增殖活性明显高于体外培养9 d和12 d后冻存组CIK细胞,复苏72 h时,6、9、12 d冻存组CIK细胞数分别为(35.90±1.67)×106、(18.98±2.13)×106和(11.76±2.12)×106个（P<0.01）。 体外培养6、9、12 d后冻存组CIK细胞复苏24 h后,各冻存组CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞比例逐渐增加,且复苏72 h后6 d冻存组CIK细胞中CD3+CD56+和CD3+CD8+细胞比例最低。体外培养后冻存组CIK细胞在复苏24 h内对A549细胞的杀伤活性较低,但24 h后细胞毒活性有较大幅度的增加,且体外培养12 d后冻存组CIK细胞对A549细胞的杀伤活性高于6 d和9 d冻存组CIK细胞,如复苏后72 h,12、6、9 d冻存组CIK细胞对A549细胞的抑瘤率分别为（0.81±009）%、（0.59±0.06）%、（0.42±0.08）%（P<0.01）。ELISA检测结果显示,随着复苏时间的延长,体外培养不同时间后冻存的CIK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平也逐渐上升;复苏72 h时,体外培养6 d后冻存组CIK细胞分泌IFN-γ的量要高于其他组,而体外培养12 d后冻存组TNF-α的分泌量则明显高于其他组。 结论： 体外培养不同时间后冻存对CIK细胞的生物学活性有一定影响,但复苏后经短时间培养后基本恢复,提示CIK细胞可以在培养至12 d后进行冻存。     

CIK细胞治疗难治复发性非霍奇金淋巴瘤临床观察

 目的 探讨细胞因子活化杀伤细胞（CIK细胞）用于难治复发性非霍奇金淋巴瘤的安全性及疗效。方法 健康供者及淋巴瘤患者的外周血单个核细胞,经过IFN-γ、CD3单抗和rhIL-2共同作用,体外扩增培养CIK细胞,流式细胞仪检测其免疫表型的改变,MTT法检测CIK细胞的杀伤活性。取培养15～21 d的CIK细胞回输,观察临床疗效及不良反应。结果 健康供者及恶性淋巴瘤患者的外周血单个核细胞可以成功培养出CIK细胞。培养第21天,CIK细胞扩增至52.67～64.81倍。培养期内细胞存活率95 %以上。流式细胞仪检测其免疫表型有明显的变化,CD+3 CD+56细胞比例由培养第0天的0.52 %～3.04 %上升至第21天的48.63 %～75.82 %,而CD+3 CD+8细胞则由21.2 %～33.5 %升至82.26 %～92.32 %。MTT法检测CIK细胞对K562细胞有较高的杀瘤活性,当效靶比为5∶1时,在细胞培养的第21天,CIK对K562细胞的杀伤活力为58.1 %～70.9 %。在4例接受CIK细胞治疗患者中,治疗前后临床症状有明显的改善,T细胞亚群测定显示CD4／CD8比值（1.03±0.24～1.26±0.31）及CD+16 CD+56细胞（10.91±6.23～15.68±7.42）与治疗前相比明显升高。治疗过程中及治疗后患者无明显不良反应。结论 CIK细胞可以成为难治复发性非霍奇金淋巴瘤的有效治疗手段之一。     

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的： 通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。 方法: 建立4种NK细胞体外培养方案：方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基（IL-2+OKT3）。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群（尤其是NK细胞）的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果： 上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增（40.1±20.00）、（44.08±22.09）、（44.82±23.67）、（46.82±2502）倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为（75.86±28.57）、（93.32±32.16）、（88.66±24.94）,（58.88±41.53）倍。NK细胞比例由0 d的（20.44±2.23）%分别扩增至15 d的（48.30±13.90）%、（54.72±12.25）%、（55.94±12.70）%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义（P>0.05）。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4\[（63.40±500）%、（77.30±9.40）%、（62.17±5.60）% vs （37.39±10.42）%,均P<005\],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义（P>0.05）。 结论： 细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合（方案1中是否加入IL-18或IL-7）对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。     

肝癌特异性靶标致敏DC诱导CIK细胞对肝癌HuH-7细胞及移植瘤的抑制

目的：观察负载肝癌特异性DC靶标的树突状细胞（dendritic cell,DC）与细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer cell,CIK）细胞共培养后对肝癌细胞HuH-7的杀伤作用以及对裸鼠肝癌移植瘤的治疗效果。 方法： 外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞。分别利用肝癌特异性DC靶标和肝癌HuH-7细胞冻融抗原刺激DC,ELISA法测定其对DC IL-12分泌的影响。DC HuH-7、DC target分别与CIK细胞共培养后,ELISA法检测其对CIK细胞IFN-γ分泌的影响,CCK-8法检测效靶比为10〖DK〗∶1、20〖DK〗∶1、40〖DK〗∶1、100〖DK〗∶1时DCHuH-7-CIK和DC target-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤作用。构建HuH-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、CIK组、DC HuH-7-CIK组和DC target-CIK组,尾静脉注射细胞悬液,观察效应细胞的抑瘤效果。 结果： DC HuH-7与DC target的IL-12 p70分泌水平较DC显著升高\[（179.33±14.04）、（173.33±6.66） vs （59.33±1184）pg/ml,均 P <0.01\];与CIK细胞共培养后,DC HuH-7-CIK与DC target-CIK细胞分泌IFN-γ的能力也显著高于DC-CIK细胞（均 P <0.01）,且DC HuH-7-CIK与DC target-CIK细胞之间无显著差异（ P >0.05）。在相同效靶比时,DC HuH-7-CIK细胞以及DC target-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤活性明显高于单纯CIK细胞（ P <0.05）,且DC HuH-7-CIK与DC target-CIK组之间无显著差异（ P >0.05）。DC target-CIK细胞对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用与DCHuH-7-CIK细胞相仿,且均显著高于单纯CIK细胞\[(78.48±1458)%、(85.78±15.69)% vs (54.69±28.07)%,均 P <0.05\],无明显不良反应。 结论： 肝癌特异性DC靶标能够显著提高CIK细胞对HuH-7细胞及其裸鼠移植瘤的杀伤活性,可替代肝癌组织抗原负载DC。     

脐血来源的CIK细胞大容量制备方法的建立

目的:探讨脐血来源的CIK细胞大容量培养方法,研究一种运用于临床治疗的细胞制剂,以期用于恶性血液病及实体瘤的免疫治疗。方法:脐血取自妊娠足月正常分娩的产妇。两步离心法加Ficoll分离出脐血单个核样细胞,在含5%正常人AB血清的液体培养体系中加入γINF、CD3单克隆抗体、IL2诱导CIK细胞扩增,流式细胞仪检测CIK细胞对K562、Raji细胞的杀伤活性。结果:每份脐血分离后可获得(0.8～1.2)×108单个核样细胞,加细胞因子扩散10天后,CIK细胞增殖最高,达60～100倍以上,30天后趋缓。CD3+CD56+细胞双表达由培养前1.0%～1.2%到30.0%～80.1%。对K562、Raji细胞的杀伤活性在效、靶比为5∶1时达50.0%～71.7%,培养14天时最高,30天后逐渐降低。结论:采用药用细胞因子及正常人血清培养脐血来源的CIK细胞,具有增殖旺盛、对K562、Raji细胞的杀伤活性强的特点,可以安全地应用于临床治疗。     

MicroRNA-17-5p反义寡核苷酸阻滞白血病K562细胞的细胞周期

目的： 以反义寡核苷酸技术研究microRNA-17-5p（miR-17-5p）对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响及其可能的机制。 方法： 脂质体法将miR-17-5p反义寡核苷酸（miR-17-5p antisense oligonucleotide,miR-17-5p-ASO）和对照无义寡核苷酸（control nonsense oligonucleotide,Ctrl-NSO）转染入K562细胞,同时设未转染对照组（Ctrl）。 MTT法检测K562细胞的增殖,TUNEL法检测K562细胞的凋亡,流式细胞术检测K562细胞周期的改变。 结果： MTT检测结果显示,miR-17-5p-ASO组K562细胞增殖活性为Ctrl-NSO组的(61.7±4.7)%,miR-17-5p-ASO转染显著抑制K562细胞的增殖（P<0.05）。TUNEL检测显示,miR-17-5p-ASO转染不影响K562细胞凋亡（P>0.05）;miR-17-5p-ASO组K562细胞G2期细胞比例为(10.8±08)％,显著低于Ctrl-NSO组和Ctrl组的(34.6±0.4)％和(33.9±1.3)％(P<0.05)。 结论： MiR-17-5p反义寡核苷酸可以通过调控细胞周期抑制K562细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新手段。     

CIK、DC-CIK细胞对神经母细胞瘤细胞杀伤作用的研究

目的：研究细胞因子诱导的杀伤细胞（ CIK）与树突状细胞（ DC）共培养后对神经母细胞瘤（ neuro-blastoma,NB）细胞株的杀伤作用。方法：取健康人和肿瘤患者外周血单个核细胞（ PBMC）,加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,用流式细胞术测定诱导培养前后DC和CIK细胞的表型,MTT法测定不同组CIK细胞对NB细胞株的杀伤活性。结果：流式细胞仪检测健康人PBMC培养后CD3＋CD56＋淋巴细胞百分比以及对NB细胞株的杀伤活性均显著高于肿瘤患者（ P〈0.05）。此外,与单纯CIK细胞相比,DC-CIK细胞具有更强的杀伤NB细胞株的活性（ P〈0.05）。结论：DC-CIK细胞是一种细胞毒作用高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。健康人和肿瘤患者的PBMC经诱导培养获得的CIK细胞有显著差别,为临床进一步提高CIK细胞的治疗效果提供了实验依据。     

IL-21 增强CIK细胞对食管癌EC9706 细胞的杀伤作用及其可能的机制

目的：探讨细胞因子IL-21 对CIK 细胞体外杀伤食管癌EC9706 细胞活性的影响,并初步分析其可能的分子机制。方法：体外无菌分离人外周血单个核细胞,分别进行常规培养和加IL-21 培养CIK细胞。流式细胞术检测2 种培养CIK细胞的免疫表型,LDH释放法检测2 种培养CIK 细胞杀伤食管癌EC9706 的活性,ELISA 法检测2 种CIK 细胞培养上清液IFN-γ 浓度。结果：常规培养和加IL-21 培养的2 种CIK细胞增殖数量无明显差异。加IL-21 培养的CIK细胞CD3+CD56+细胞比例、CD3+细胞内颗粒酶B 和穿孔素表达率均显著高于常规培养CIK 细胞[(26.95±3.53)% vs (16.18±1.04)%,(33.29±2.30)% vs (23.58±2.28)%和(59.70±1.91)% vs (45.96±2.67)%,均P<0.05）。效靶比20∶1 和30∶1 时,加IL-21 培养的CIK细胞杀伤EC9706 细胞的活性均显著高于常规培养的CIK 细胞[20∶1 时:(43.66±1.99)% vs (34.59±1.75)%;30∶1 时：57.52±2.15)% vs (42.23±1.87)%,均P<0.05]。加IL-21培养CIK细胞的上清液FN-γ 的浓度明显高于常规培养CIK细胞的上清液[(142.7±13.4) vs (42.6±3.3) ng/L,P<0.05]。结论：IL-21增加CD3+CD56+细胞比例和颗粒酶B及穿孔素的表达,提高CIK细胞分泌IFN-γ,从而增强CIK细胞对EC9706 细胞的杀伤活性。