利用气升式生物反应器培养铁皮石斛原球茎

目的:探明影响反应器内铁皮石斛原球茎生长及物质合成的因素,为铁皮石斛原材料的大量生产提供一种新方法.方法:利用3L气升式生物反应器,以组培原球茎为材料,研究了接种量、光照强度和通气量对原球茎增殖生长和多糖及石斛碱积累的影响.结果:当接种量为10g· L-1时,培养30 d后原球茎颜色深绿,生长健壮.多糖含量在接种量处理间无差异,但石斛碱含量有差异(接种量10g· L-1处理最高),多糖和石斛碱生产量在10g·L-1接种密度中最高.光照强度1600lx条件下原球茎生长最旺盛,光照对铁皮石斛原球茎多糖的积累起到促进作用,但对石斛碱的积累则有抑制作用,多糖含量和生产量在1 600,2 400 lx光照处理下好于暗条件处理;石斛碱的含量虽然在暗处理中最高,但因原球茎生长不佳,石斛碱的生产量在1 600 lx的光照强度处理中出现最大值.通气量为0.2(空气体积/培养体积/min)时原球茎生长健壮,颜色鲜绿,生长优于0.1,0.3处理,且多糖和石斛碱含量和产量均达最大值.结论:在工作体积为2L的气升式球型生物反应器内,接入10g·L-1原球茎外植体,光照强度调节为1 600 lx,通气量为0.2有利于原球茎生长和多糖及石斛碱的生产,铁皮石斛原球茎生物反应器培养是大量快速生产多糖和石斛碱的有效途径.     

不同光照强度和培养时间下铁皮石斛类原球茎生物量、多糖和生物碱量的动态变化

目的探讨不同光照强度下铁皮石斛类原球茎(PLBs)生物量、主要药用成分多糖和生物碱的动态变化规律。方法以MS为基本培养基,采用光照强度单因素试验设计,烘干法测定生物量,苯酚-硫酸法测定多糖量,酸性染料比色法测定生物碱量,数据采用SPSS 16.0软件包分析。结果铁皮石斛PLBs生物量在光照强度≥2 000 lx下培养40～50 d均较高,生产上需要PLBs维持旺盛的分裂,获得最高生物量的培养条件为光照强度2 000 lx条件下培养40 d,生物量达到0.74 g;多糖量以光照强度2 000 lx下培养30 d最高,达到16.88%;生物碱量以光照强度500 lx下培养30 d最佳,达到0.028 0%。结论不同的光照强度和培养时间对铁皮石斛PLBs的生长、多糖和生物碱的变化有显著影响,适宜的光照强度和培养时间对铁皮石斛主要药用成分的生产具有重要的实践意义。     

影响铁皮石斛类原球茎诱导和增殖生长因素研究

目的:提高铁皮石斛类原球茎诱导和增殖生长率。方法:以铁皮石斛幼芽为材料,采用1/2MS+2%蔗糖+10%香蕉泥+0.8%琼脂、p H值6.0为基本培养基。研究铁皮石斛类原球茎诱导的最佳激素浓度;类原球茎不同生理状态、接种外植体大小、培养天数、叠层培养方法对类原球茎增殖生长的影响。结果:类原球茎诱导添加6-BA 0.3 mg/L、NAA 0.2 mg/L为最佳浓度组合;颜色淡黄、疏松饱满的类原球茎增殖和增重迅速;最适的培养时间为45 d左右;相同生理状态的类原球茎以10个为一团接种,培养45 d增殖和增重最为显著,增殖率高达1008%,植株再生能力增强,平均每克类原球茎增殖后可再生植株1 132株;叠层培养上层类原球茎增殖和增重效果好,此法也可进行类原球茎复壮。结论:筛选出促进铁皮石斛类原球茎诱导最佳激素浓度组合和增殖生长技术参数,完善了铁皮石斛类原球茎诱导和增殖生长技术体系。     

贯叶连翘不定根反应器培养的初步研究

目的:对贯叶连翘不定根进行反应器培养,寻找适合不定根生长的适宜条件,为大量生产贯叶连翘不定根提供理论依据.方法:利用5L气升式生物反应器研究了IBA浓度、糖种类和浓度、不定根的接种量和通气量等影响因子对贯叶连翘不定根培养的影响.结果:在MS培养基中培养贯叶连翘不定根,随着IBA浓度的增加,贯叶连翘不定根增殖系数呈增长趋势,当IBA质量浓度在1.25～1.75 mg·L-1时不定根生长良好;在糖种类和浓度试验中,发现以蔗糖为碳源培养的不定根生长最好,增殖系数达最大值22.15,当蔗糖质量浓度为30g·L-1时鲜物重、干物重和增殖系数均达最大值;在接种量试验中,结果表明当反应器的接种量为20 g时有利于不定根的生长;在通气量试验中,当反应器的通气量为0.075(空气体积/培养体/min)时,不定根的生长最旺盛,不定根的增殖系数显著增加;在不同大小反应器中培养不定根,发现不定根在5L反应器中的培养条件完全适用于10,20 L的反应器.结论:IBA浓度、糖种类和浓度、不定根的接种量和通气量对贯叶连翘不定根的生物反应器培养有显著影响.     

铁皮石斛的种胚萌发及其离体繁殖研究

目的:研究铁皮石斛种胚萌发和快速繁殖的组织培养技术,为铁皮石斛的繁殖建立最佳培养条件。方法:以成熟的铁皮石斛种胚为研究材料,以1/2MS为基本培养基,接种到含有不同植物生长物质BA(6-苄基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)组合及含有马铃薯提取液、香蕉提取物及活性碳的培养基上,诱导铁皮石斛种胚的萌发、原球茎增殖、分化及试管苗生根。结果与结论:添加20%马铃薯液有利于种胚的萌发,种胚萌发率为79.37%;BA 1.0 mg.L^-1和NAA 0.1 mg.L^-1最有利于原球茎增殖,培养基中添加2%活性碳原球茎增殖倍数高;NAA有助于试管苗的生根,不同含量NAA以0.5 mg.L^-1时试管苗平均根数最多和平均根长最长。     

铁皮石斛茎段原球茎的诱导增殖与分化

目的:探讨植物生长调节剂、基本培养基、蔗糖质量浓度以及相关添加物对铁皮石斛茎段原球茎的诱导、增殖、分化以及根部生长等方面的影响。方法:通过正交试验方式,要求没有添加激素下,对铁皮石斛茎段原球茎进行消毒处理、试验培养基的配备、对原球茎进行诱导、对原球茎进行增殖和分化处理、生根的培养等,分析不同植物生长调节剂、基本培养基配比对于茎段原球茎的诱导影响,不同基本培养基、马铃薯泥以及蔗糖浓度增殖分化原球茎效果,以及香蕉泥、萘乙酸(NAA)和马铃薯泥对铁皮石斛茎段原球茎生根效果。结果:1)最适宜诱导铁皮石斛茎段原球茎的培养基组合是NAA 0.1 mg/L+1/2MS(Murashige and Skoog)培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)4 mg/L。2)铁皮石斛茎段原球茎增殖最佳的培养基是:MS+蔗糖30 g/L;分化的最佳培养基是:马铃薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2 MS。3)铁皮石斛茎段原球茎的生根最佳培养基组合是马铃薯泥10%+1/2 MS+NAA 1 mg/L+香蕉泥10%。结论:在没有添加激素的前提下,基于正交试验方式发现变化蔗糖含量和基本培养基能够对铁皮石斛茎段原球茎增殖和分化效果进行调节,并找出了最理想的组合模式。     

铁皮石斛原球茎高效再生体系的研究

目的以铁皮石斛Dendrobium officinale实生种子为外植体,研究铁皮石斛原球茎的增殖、分化、诱导生根等条件,筛选出适宜铁皮石斛原球茎高效再生的诱导条件,建立高效的再生体系。方法以铁皮石斛种子为外植体,在培养基上诱导产生原球茎,经过增殖培养后,转移到分化培养基中诱导芽苗分化,待分化的芽苗长到1~2 cm时,转移到生根培养基诱导生根,最终长成完整的再生植株。结果适宜铁皮石斛生长的基本培养基为1/2 MS;原球茎诱导的培养基为1/2 MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+50 g/L土豆泥;原球茎增殖的最适培养基为1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,最高增殖系数达23;最佳分化培养基为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,平均分化率最高达95%;最佳生根培养基为1/2 MS+0.3mg/L NAA+50 g/L土豆泥,生根率达100%。结论铁皮石斛实生种子是铁皮石斛离体繁殖的优良外植体来源。以铁皮石斛种子诱导获得的高效再生技术体系可以为铁皮石斛快速繁殖和工厂化生产提供理论基础。     

太子参不定根组织培养的研究

目的:对太子参不定根的培养条件进行系统的优化.方法:利用组织培养技术结合紫外分光光度法,考察了接种量、蔗糖浓度、无机盐浓度、培养天数、逐级扩大培养以及不同角度鼓泡式反应器对太子参不定根生长的影响,并对不定根中皂苷、多糖和氨基酸等成分进行含量测定.结果:每1L培养基接种的不定根鲜重为6 g时,太子参不定根的干重增殖倍数达到最大值;随着蔗糖浓度的升高,太子参不定根干重增殖倍数呈先升高后降低的趋势;培养基中的无机盐浓度对不定根的生长有较大影响,3/4 MS最有利于不定根的生长;太子参生长呈“S”型曲线,在第28天生物量达到最大.结论:接种量、蔗糖浓度、无机盐浓度、逐级扩大培养以及反应器角度都会显著影响太子参不定根的生长,不定根中的皂苷和氨基酸含量高于栽培的太子参,而多糖含量低于栽培的太子参.     

铁皮石斛原球茎的诱导与增殖影响因素研究

目的:研究铁皮石斛原球茎诱导与增殖的最适培养基配方。方法:以铁皮石斛种胚为材料,以MS培养基为基本培养基,研究不同植物激素6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和激动素(KT)或其组合及马铃薯提取液(PE)、香蕉提取液(BE)、苹果提取液(AE)和椰乳(CM)等有机添加物对铁皮石斛原球茎诱导和增殖的影响。结果:6-BA与NAA配比不利于种胚萌发,萌发度均低于MS培养基;添加10%的PE、CM有利于原球茎诱导;2,4-D对原球茎的生长和增殖不利,一定浓度的BA、KT和NAA有利于原球茎的增殖;KT浓度为1.0 mg/L时,原球茎40 d增殖倍数最高,达9.0;PE、CM、AE都能不同程度的促进原球茎的增殖,以10%的CM效果最好。结论:适宜铁皮石斛原球茎的诱导培养基为MS+10%CM+1.0 g/L AC;适宜铁皮石斛原球茎增殖的培养基为MS+1.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+10%CM。     

铁皮石斛原球茎悬浮培养研究

目的　建立铁皮石斛原球茎悬浮系 ,作为人工种子繁殖体。方法　对铁皮石斛原球茎悬浮培养条件进行比较选择 ,并测定生长增殖状况。结果　悬浮培养的原球茎分散性好、整齐均一。悬浮培养的最适培养基为 1/ 4 MS+40 mg/ L Vc,p H5 .6 ,摇床转速为 5 0 r/ m in,15 d继代一次 ,黑暗培养。培养基中添加 0 .5 m g/ LABA预培养 30 d,原球茎的质量提高、同步性更好。结论　首次报道了铁皮石斛原球茎悬浮系的建立 ,为铁皮石斛大规模培养开创了新途径。     

千金子制霜前后提取物对大鼠肠道菌群的影响

目的研究千金子制霜前后提取物对正常大鼠肠道菌群的影响,为进一步阐明千金子制霜减毒机制提供参考。方法大鼠ig高、中、低剂量的千金子生品和霜品提取物,采用平板菌落计数法考察千金子制霜前后大鼠粪便中4类代表性肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的数量变化。结果平板菌落计数实验结果表明,ig千金子生品与霜品提取物后大鼠出现菌群失调现象,且千金子霜品较生品引起的菌群紊乱程度低,在低剂量给药时可使条件致病菌肠球菌和大肠杆菌的数量减少。结论千金子制霜前后提取物均会影响肠道菌群的生物多样性,影响肠道菌群平衡,且千金子制霜后对4类肠道菌群的作用减弱,引起肠道菌群紊乱程度减小,这与千金子霜品泻下作用缓和的研究结果相一致,表明从肠道微生态角度考察千金子制霜前后对肠道菌群的干预作用,可揭示制霜与肠道菌群数量变化可能存在相关性。     

基于毛蕊花糖苷含量分析陈皮和砂仁在熟地黄炮制中的影响性研究

[目的] 针对熟地黄的药性特点，深入研究熟地黄炮制过程中，陈皮与砂仁对其炮制过程中毛蕊花糖苷含量的影响，并建立超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）法检测熟地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，并根据其含量变化，验证其炮制方法的科学性与合理性，为丰富熟地黄的炮制品种并建立其质量控制标准提供参考。[方法] 参考熟地黄在全国各省市《中药炮制规范》中的炮制方法，采用其中具有临床实用特色的方法，即：陈皮制熟地黄、砂仁制熟地黄（酒蒸法和拌制法），并以2015版《中华人民共和国药典》中熟地黄的质量标准为参照指标，采用UPLC-MS检测技术对其炮制过程中毛蕊花糖苷的含量变化进行研究，并结合性状评分，进行综合评价及统计学分析。[结果] 检测的线性范围为（1~1 000 ng/mL，r=1），其精密度、重复性、稳定性、准确度均较好（RSD<3%）。本实验中炮制后的熟地黄其毛蕊花糖苷的含量均超过药典标准，在炮制过程中当性状达到药典及传统标准时，其毛蕊花糖苷的含量能保持在较高水平，以陈皮制熟地黄后的毛蕊花糖苷含量最高，炮制过程中含量变化最显著。[结论] 陈皮制熟地黄可明显稳定和控制毛蕊花糖苷在熟地黄炮制过程中的下降趋势。这对通过相应的炮制方法，在有效保存熟地黄指标性成分的同时，扩大熟地黄临床使用范围有积极意义。同时UPLC-MS法由于操作简便、速度快、准确度高，可用于熟地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量的检测。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量测定

目的:建立肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量方法.方法:采用紫外分光光度法,以去氢二异丁香酚为对照品,测定波长275 nm.结果:去氢二异丁香酚质量浓度在1.5～9.0 mg·L-1与吸光度呈良好线性关系,r=0.999 8,平均回收率97.6％(n=6),RSD 1.2％.结论:建立的方法简便、快速、重复性好.     

酸碱药对甘草-马钱子配伍汤液沉积相态释放特性研究

目的 探讨甘草-马钱子配伍汤液沉积相态的释放行为,为甘草-马钱子配伍减毒提供科学参考。方法 建立沉积相态释放测定HPLC法,通过体外释放实验,追踪沉积相态在蒸馏水、人工胃液、人工肠液等不同介质中主成分的释放行为,并对其释放结果进行拟合研究分析。结果 甘草酸、马钱子碱以及士的宁在人工肠液中的释放量较大,且马钱子碱>甘草酸>士的宁。马钱子碱和甘草酸均与一级动力学模型拟合结果最佳,士的宁与Higuchi模型拟合结果最佳。结论 甘草-马钱子沉积相态主要毒效成分呈现出难溶性骨架材料缓释制剂的释放特性,毒(效)成分士的宁可能以沉积共聚体形式存在,在体释放呈缓释行为而减毒;同时,甘草酸的释放对减毒增效起到协同作用。     

动态观测艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药对脂多糖致发热大鼠生理指标的影响

目的基于中医整体观、动态观,平行比较艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药调节脂多糖(LPS)致发热模型大鼠生理指标的作用节点及强度。方法采用Data Science International(DSI)植入式生理信号遥测技术,动态观测开窍药对模型大鼠体温(T)、心率(HR)、血压(SBP、DBP)、活动度(A)等生理参数的影响,用SPSS 17.0、SAS 9.2、Origin Pro 8.5处理数据及作图。结果 3种冰片(艾片、天然冰片、合成冰片)对模型大鼠的T、HR有抑制作用,艾片最优;苏合香对模型大鼠HR、SBP、DBP、A等总体呈现先兴奋后抑制趋势;安息香对各项指标无显著影响。主成分分析结果显示天然冰片、苏合香对模型大鼠作用有一致倾向性;合成冰片能同时对A、SBP、DBP产生较大影响。聚类分析和对应分析均表明3种冰片的作用特点可归为一类;苏合香、安息香具有各自作用规律。结论 3种冰片对各生理指标有抑制作用;苏合香整体呈现出先兴奋后抑制趋势,可能与其性温的时间窗有关;安息香对发热模型无显著影响,可能与其平性相关;今后可从开窍药对该模型大鼠作用机制展开研究。     

夏天无HPLC指纹图谱及多指标含量测定研究

目的建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法,为夏天无药材质量标准提升提供科学依据。方法采用HPLC法,Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调pH 6.0)为流动相,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;进样量10μL;检测波长280 nm;建立15批夏天无药材的指纹图谱,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012A版)进行评价,聚类分析和主成分分析将15批药材分为2类,同时测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4种成分的含量。结果建立了夏天无药材的HPLC指纹图谱,共标定了10个共有峰;原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素线性关系良好,r均大于0.999 9,平均回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%。结论 HPLC指纹图谱结合多指标成分测定可为夏天无药材质量评价提供参考。     

配伍药物与pH值环境对大黄蒽醌类成分溶出变化的影响规律

目的 研究配伍药物与pH值环境对大黄药对中蒽醌类成分溶出变化的影响规律。方法 首先检测与大黄配伍的药物（醋甘遂、牡丹皮、黄芩、黄连、附子、枳实、厚朴）单煎液的pH值,然后在相同pH值的水溶液中加入大黄进行煎煮,采用UV-Vis法和HPLC法测定此pH值的水煎液中蒽醌类成分的量,与大黄药对共煎液中蒽醌类成分的量进行比较。结果 UV-Vis法检测结果显示,大黄与黄连配伍时,总蒽醌的溶出量最低,而大黄与黄芩配伍时总蒽醌的溶出量最高。用盐酸水溶液提取大黄,总蒽醌的溶出量随pH值升高而增加;HPLC法测定结果显示,在测定的7个药对中,黄连与大黄配伍时,蒽醌类成分溶出量最低,而附子与大黄配伍时,蒽醌类成分的溶出量最高。使用不同pH值的盐酸水溶液提取大黄时,蒽醌类成分的量在pH值为5.6时最高。结论 大黄在煎煮过程中,与其配伍的药物和pH值环境均会引起蒽醌类成分溶出量的变化,但是不同药物配伍后形成的pH值环境与用盐酸调整的pH值环境对蒽醌类成分产生的影响存在不一致性,pH值环境对其影响较大。     

内生真菌链格孢菌醋酸乙酯提取物对大肠杆菌抑菌机制的研究

目的研究分离自药用植物白毛蛇Humata tyermanni的内生真菌链格孢菌发酵产物醋酸乙酯提取物(B06e)对大肠杆菌的抑菌机制。方法采用倍比稀释法测定了B06e对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC);测定了B06e作用前后大肠杆菌培养液电导率、核酸和蛋白质的变化;结合流式细胞仪、扫描电子显微镜、凝胶阻滞实验、圆二色谱和荧光实时定量PCR的分析方法研究了B06e对大肠杆菌细胞膜结构、形态、DNA的影响。结果 B06e对大肠杆菌的MIC为25μg/m L,3×MIC处理组的电导率是对照组的1.01倍;3×MIC处理组的β-半乳糖苷酶活性是对照组的11.6倍;流式细胞仪分析表明3×MIC处理组被碘化丙啶(PI)染色的阳性细胞比是对照组的286.5倍;扫描电子显微镜结果显示,B06e处理后菌体表面变得粗糙,细胞膜大量塌陷;以上结果说明B06e能增大细胞膜的通透性,破坏细胞膜的完整性。凝胶阻滞、圆二色谱的结果表明,B06e能够以嵌插的方式与DNA结合,但不能降解DNA;实时定量PCR结果表明,经B06e处理后rec A和rec N基因的表达量分别是对照组的2.9和3.7倍,说明B06e能破坏DNA的结构,迫使大肠杆菌启动了SOS修复。结论 B06e通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性和DNA的结构,使得细菌代谢紊乱,最终导致细菌丧失了生长繁殖的能力。